Visualizzazione e quantificazione dei dati di citometria ad alta dimensione utilizzando Cytofast e i metodi di clustering a monte FlowSOM e Cytosplore
Summary
Cytofast è uno strumento di visualizzazione utilizzato per analizzare l’output dal clustering. Cytofast può essere utilizzato per confrontare due metodi di clustering: FlowSOM e Cytosplore. Cytofast può generare rapidamente una panoramica quantitativa e qualitativa dei dati sulla citometria di massa ed evidenziare le principali differenze tra i diversi algoritmi di clustering.
Abstract
La complessità dei dati generati dalla citometria di massa ha reso necessari nuovi strumenti per visualizzare rapidamente i risultati analitici. Metodi di clustering come Cytosplore o FlowSOM vengono utilizzati per la visualizzazione e l’identificazione di cluster cellulari. Per l’analisi a valle, un pacchetto R appena sviluppato, Cytofast, può generare una rapida visualizzazione dei risultati dei metodi di clustering. Cytofast prende in considerazione la caratterizzazione fenotipica degli ammassi cellulari, calcola l’abbondanza di ammassi di cellule, quindi confronta quantitativamente i gruppi. Questo protocollo spiega le applicazioni di Cytofast all’uso di dati di citometria di massa basati sulla modulazione del sistema immunitario nel microambiente tumorale (cioè la risposta cellulare killer naturale [NK]) su una sfida tumorale seguita da immunoterapia (blocco PD-L1). Viene mostrata la dimostrazione dell’utilità di Cytofast con FlowSOM e Cytosplore. Cytofast genera rapidamente rappresentazioni visive di cluster di cellule immunitarie correlate al gruppo e correlazioni con la composizione del sistema immunitario. Le differenze si osservano nell’analisi del clustering, ma la separazione tra gruppi è visibile con entrambi i metodi di clustering. Cytofast mostra visivamente i modelli indotti dal trattamento PD-L1 che includono una maggiore abbondanza di sottoinsiemi di cellule NK attivati, esprimendo una maggiore intensità di marcatori di attivazione (ad esempio, CD54 o CD11c).
Introduction
La citometria di massa (citometria per tempo di volo, o CyTOF) consente il rilevamento di un’ampia gamma di biomarcatori intracellulari o extracellulari in milioni di singole cellule. La natura ad alta dimensione dei dati di citometria di massa richiede alcuni strumenti di analisi, come le tecniche di clustering delle cellule come SPADE1, FlowMaps2, FlowSOM3, Phenograph4, VorteX5e mappe scaffold6. Inoltre, sono state sviluppate varie tecniche basate sulla riduzione della dimensionalità (cioè, analisi dei componenti principali [PCA]7, vicini stocastici distribuiti in t incorporando [t-SNE]8, vicina stocastica gerarchica incorporando [HSNE]9, approssimazione e proiezione dei collettori uniformi [UMAP]10e mappe11)per migliorare la velocità, l’interpretazione e la visualizzazione di set di dati dimensionali elevati.
L’analisi a valle dei dati citometrici di massa e di flusso tridimensionale elevato spesso manca di processi automatici per eseguire test statistici sulla frequenza dei cluster e collegamenti con i risultati clinici. In precedenza, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro basato su R noto come Cytofast12, che consente analisi a valle visive e quantitative delle tecniche di clustering di Cytosplore o FlowSOM.
Il protocollo qui descritto chiarisce l’uso di Cytofast in R e mostra come generare mappe di calore e grafici quantitativi e qualitativi. Inoltre, facilita la determinazione delle connessioni tra i fenotipi immunitari osservati e gli esiti clinici. Questo report descrive anche l’analisi di un set di dati di citometria di massa specifico utilizzando due diverse procedure di clustering: FlowSOM e Cytosplore. Utilizzando Cytofast con entrambi i metodi di clustering, si di conseguenza è dimostrato che il fenotipo di attivazione delle cellule NK è influenzato dal blocco del checkpoint immunitario PD-L1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytofast è uno strumento computazionale rapido che fornisce un’esplorazione rapida e globale dei dati citometrici evidenziando e quantificando sottoinsiemi cellulari specifici del trattamento. Il protocollo descritto mira a elaborare ulteriormente le analisi di clustering con Cytosplore o FlowSOM. Altri strumenti di analisi del clustering sono adatti per Cytofast, ma ciò richiede l’utilizzo di Cytofast per assegnare ogni cella a un sottoinsieme. Cytofast, tuttavia, non è un metodo di clustering e pertanto richiede procedure di clustering prima dell’uso.
L’analisi eseguita qui ha mostrato che alcuni sottoinsiemi di cellule CD161– NK nel microambiente tumorale erano sensibili a un blocco PD-L1. Ciò è stato dimostrato da cambiamenti nel loro fenotipo e abbondanza, che sono stati osservati utilizzando sia Cytosplore che FlowSOM come metodi di clustering. Entrambi i metodi distinguevano il principale cluster di cellule NK (CD11b, NKG2A)con frequenze leggermente diverse (15%-20% per Cytosplore, 30%–40% per FlowSOM). Le differenze in abbondanza e questa approssimazione non hanno influenzato il modello globale, perché entrambi i dendrogrammi visualizzati nei pannelli di destra di Figura 2 e Figura 3 ha mostrato risultati simili. Utilizzando Cytofast, è quindi possibile (indipendente mente dal metodo di clustering scelto) separare i topi trattati con PD-L1 e non trattati sulla base di analisi del fenotipo e dell’abbondanza di cluster di cellule NK.
A seconda dei parametri registrati, sono necessarie modifiche al protocollo. In particolare, alcuni parametri, ad esempio il tempo e lo sfondo, devono essere rimossi durante l’esecuzione dell’analisi del clustering. Inoltre, è importante che ogni cella sia assegnata a un sottoinsieme. La funzione cfData aggiungerà semplicemente i conteggi di celle non elaborate per cluster per campione in cfList. Da questa fase, la mappa del citoheat può essere costruita come spiegato nella sezione 3.
Cytofast è stato utilizzato con successo come strumento di visualizzazione e quantificazione per confrontare diversi metodi di clustering13. Questo pacchetto R è compatibile anche con funzionalità avanzate, come globaltest14, che possono testare le associazioni tra gruppi di cluster utilizzando variabili cliniche. In futuro, lo strumento globaltest e altri algoritmi possono essere integrati con Cytofast per una visualizzazione e una quantificazione più approfondite.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo il finanziamento da parte della Commissione europea di un premio H2020 MSCA nell’ambito della proposta numero 675743 (ISPIC). Ringraziamo Tetje van der Sluis e Iris Pardieck per aver testato il protocollo.
References
- Anchang, B., et al. Visualization and cellular hierarchy inference of single-cell data using SPADE. Nature Protocols. 11 (7), 1264-1279 (2016).
- Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16 (3), 323-337 (2015).
- Van Gassen, S., et al. FlowSOM: Using self-organizing maps for visualization and interpretation of cytometry data. Cytometry A. 87 (7), 636-645 (2015).
- Levine, J. H., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13 (6), 493-496 (2016).
- Spitzer, M. H., et al. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425 (2015).
- Hotelling, H. Analysis of a complex of statistical variables into principal components. Journal of Educational Psychology. 24 (6), 417-441 (1933).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing Data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. , (2008).
- Pezzotti, N., Hollt, T., Lelieveldt, B., Eisemann, E., Vilanova, A. Hierarchical Stochastic Neighbor Embedding. Computer Graphics Forum. 35 (3), 21-30 (2016).
- Becht, E., et al. Dimensionality reduction for visualizing single-cell data using UMAP. Nature Biotechnology. 37, 38 (2018).
- Haghverdi, L., Buettner, F., Theis, F. J. Diffusion maps for high-dimensional single-cell analysis of differentiation data. Bioinformatics. 31 (18), 2989-2998 (2015).
- Beyrend, G., Stam, K., Höllt, T., Ossendorp, F., Arens, R. Cytofast: A workflow for visual and quantitative analysis of flow and mass cytometry data to discover immune signatures and correlations. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 435-442 (2018).
- Beyrend, G., et al. PD-L1 blockade engages tumor-infiltrating lymphocytes to co-express targetable activating and inhibitory receptors. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7 (1), 217 (2019).
- Goeman, J. J., van de Geer, S. A., de Kort, F., van Houwelingen, H. C. A global test for groups of genes: testing association with a clinical outcome. Bioinformatics. 20 (1), 93-99 (2004).
