Visualisierung und Quantifizierung hochdimensionaler Zytometriedaten mit Cytofast und den Upstream Clustering Methods FlowSOM und Cytosplore
Summary
Cytofast ist ein Visualisierungstool, das zum Analysieren der Ausgabe aus Clustering verwendet wird. Cytofast kann verwendet werden, um zwei Clustering-Methoden zu vergleichen: FlowSOM und Cytosplore. Cytofast kann schnell einen quantitativen und qualitativen Überblick über Massenzytometriedaten generieren und die Hauptunterschiede zwischen verschiedenen Clustering-Algorithmen hervorheben.
Abstract
Die Komplexität der durch Massenzytometrie erzeugten Daten hat neue Tools erforderlich, um analytische Ergebnisse schnell zu visualisieren. Clustering-Methoden wie Cytosplore oder FlowSOM werden für die Visualisierung und Identifizierung von Zellclustern verwendet. Für die Downstream-Analyse kann ein neu entwickeltes R-Paket, Cytofast, eine schnelle Visualisierung der Ergebnisse aus Clustering-Methoden generieren. Cytofast berücksichtigt die phänotypische Charakterisierung von Zellclustern, berechnet die Häufigkeit des Zellclusters und vergleicht dann quantitativ Gruppen. Dieses Protokoll erklärt die Anwendung von Cytofast auf die Verwendung von Massenzytometriedaten auf der Grundlage der Modulation des Immunsystems in der Tumormikroumgebung (d. h. dem natürlichen Killer [NK] Zellreaktion) bei Tumorherausforderung gefolgt von Immuntherapie (PD-L1-Blockade). Gezeigt wird die Nützlichkeit von Cytofast mit FlowSOM und Cytosplore. Cytofast erzeugt schnell visuelle Darstellungen von gruppenbezogenen Immunzellclustern und Korrelationen mit der Zusammensetzung des Immunsystems. Unterschiede werden in der Clusteringanalyse beobachtet, aber die Trennung zwischen Gruppen ist mit beiden Clusteringmethoden sichtbar. Cytofast zeigt visuell die durch die PD-L1-Behandlung induzierten Muster, die eine höhere Fülle aktivierter NK-Zell-Teilmengen enthalten und eine höhere Intensität von Aktivierungsmarkern (d. h. CD54 oder CD11c) ausdrücken.
Introduction
Die Massenzytometrie (Zytometrie durch Flugzeit oder CyTOF) ermöglicht den Nachweis einer breiten Palette intrazellulärer oder extrazellulärer Biomarker in Millionen von Einzelzellen. Die hochdimensionale Natur von Massenzytometriedaten erfordert bestimmte Analysewerkzeuge, wie z. B. Zellclustering-Techniken wie SPADE1, FlowMaps2, FlowSOM3, Phenograph4, VorteX5und Gerüstkarten6. Darüber hinaus wurden verschiedene auf Derinmaßungsreduktionbasierende Techniken entwickelt (z.B. Hauptkomponentenanalyse [PCA]7, t-verteilte stochastische Nachbareinbettung [t-SNE]8, hierarchische stochastische Nachbareinbettung [HSNE]9, einheitliche Verteilerannäherung und Projektion [UMAP]10und Diffusionskarten11), um die Geschwindigkeit, Interpretation und Visualisierung von hochdimensionalen Datensätzen zu verbessern.
Bei der nachgelagerten Analyse hochdimensionaler Strömungs- und zytometrischer Massendaten fehlen häufig automatische Prozesse zur Durchführung statistischer Tests zur Clusterhäufigkeit und Verbindungen zu klinischen Ergebnissen. Zuvor haben wir einen R-basierten Workflow namens Cytofast12entwickelt, der visuelle und quantitative nachgelagerte Analysen von Clustering-Techniken durch Cytosplore oder FlowSOMermöglicht.
Das hier beschriebene Protokoll klärt die Verwendung von Cytofast in R und zeigt, wie quantitative und qualitative Heatmaps und Graphen erzeugt werden können. Darüber hinaus erleichtert es die Bestimmung von Verbindungen zwischen beobachteten Immun-Phänotypen und klinischen Ergebnissen. Dieser Bericht beschreibt auch die Analyse eines bestimmten Massenzytometrie-Datasets mit zwei verschiedenen Clustering-Prozeduren: FlowSOM und Cytosplore. Durch die Verwendung von Cytofast mit beiden Clustering-Methoden wird entsprechend gezeigt, dass der Aktivierungsphänotyp von NK-Zellen durch die PD-L1-Immun-Checkpoint-Blockade beeinflusst wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytofast ist ein schnelles Rechenwerkzeug, das eine schnelle und globale Untersuchung zytometrischer Daten ermöglicht, indem behandlungsspezifische Zellteilmengen hervorgehoben und quantifiziert werden. Das beschriebene Protokoll zielt darauf ab, Clustering-Analysen mit Cytosplore oder FlowSOMweiter zu verarbeiten. Andere Clustering-Analysetools eignen sich für Cytofast, dies erfordert jedoch die Verwendung von Cytofast, um jede Zelle einer Teilmenge zuzuweisen. Cytofastist jedoch keine Clusteringmethode und erfordert daher Clusteringprozeduren vor der Verwendung.
Die hier durchgeführte Analyse zeigte, dass bestimmte CD161+ NK-Zellteilmengen in der Tumormikroumgebung empfindlich auf eine PD-L1-Blockade reagierten. Dies wurde durch Veränderungen in ihrem Phänotyp und Ihrer Häufigkeit belegt, die sowohl mit Cytosplore als auch mit FlowSOM als Clustering-Methoden beobachtet wurden. Beide Methoden unterschieden den wichtigsten NK-Zellcluster (CD11b+ NKG2A+) mit leicht unterschiedlichen Frequenzen (15%–20% für Cytosplore, 30% –40% für FlowSOM). Die Unterschiede in der Häufigkeit und diese Annäherung wirkten sich nicht auf das globale Muster aus, da beide Dendrogramme, die in den rechten Farbfeldern von Abbildung 2 und Abbildung 3 dargestellt waren, ähnliche Ergebnisse zeigten. Durch die Verwendung von Cytofastist es somit (unabhängig von der gewählten Clustering-Methode) möglich, PD-L1-behandelte und unbehandelte Mäuse auf der Grundlage von Analysen des NK-Zellcluster-Phänotyps und der Häufigkeit zu trennen.
Abhängig von den aufgezeichneten Parametern sind Änderungen am Protokoll erforderlich. Insbesondere müssen bestimmte Parameter wie Zeit und Hintergrund während der Clusteranalyse entfernt werden. Darüber hinaus ist es wichtig, dass jede Zelle einer Teilmenge zugewiesen wird. Die cfData-Funktion fügt einfach die unformatierten Zellenzahlen pro Cluster pro Sample in die cfList ein. In diesem Schritt kann die Cytoheatmap wie in Abschnitt 3 erläutert erstellt werden.
Cytofast wurde erfolgreich als Visualisierungs- und Quantifizierungstool zum Vergleich verschiedener Clustering-Methoden13eingesetzt. Dieses R-Paket ist auch mit erweiterten Funktionen kompatibel, z. B. dem globaltest14, der Zuordnungen zwischen Clustergruppen mithilfe klinischer Variablen testen kann. In Zukunft können das globaltest-Tool und andere Algorithmen mit Cytofast integriert werden, um eine detailliertere Visualisierung und Quantifizierung zu ermöglichen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir würdigen die Finanzierung eines H2020 MSCA-Preises durch die Europäische Kommission unter der Vorschlagsnummer 675743 (ISPIC). Wir danken Tetje van der Sluis und Iris Pardieck für das Testen des Protokolls.
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