Visualisatie en kwantificering van High-dimensionale Cytometrie gegevens met behulp van Cytofast en de upstream clustering methoden FlowSOM en Cytosplore
Summary
Cytofast is een visualisatietool die wordt gebruikt om de uitvoer van clustering te analyseren. Cytofast kan worden gebruikt om twee clustering methoden te vergelijken: Flowsom en cytosplore. Cytofast kan snel een kwantitatief en kwalitatief overzicht van Mass cytometrie gegevens genereren en de belangrijkste verschillen tussen verschillende clustering algoritmen benadrukken.
Abstract
De complexiteit van de door Mass cytometrie gegenereerde gegevens heeft nieuwe instrumenten nodig om de analytische uitkomsten snel te visualiseren. Cluster methoden zoals Cytosplore of flowsom worden gebruikt voor de visualisatie en identificatie van celclusters. Voor downstream-analyse, een nieuw ontwikkelde R-pakket, Cytofast, kan een snelle visualisatie van de resultaten van clustering methoden genereren. Cytofast houdt rekening met de fenotypische karakterisering van celclusters, berekent de overvloed van het celcluster en vergelijkt vervolgens kwantitatief groepen. Dit protocol verklaart de toepassingen van Cytofast aan het gebruik van massa cytometrie gegevens op basis van modulatie van het immuunsysteem in de tumor micro omgeving (dat wil zeggen, de Natural killer [NK] Cell Response) op tumor Challenge gevolgd door immunotherapie (PD-L1 blokkade). Demonstratie van het nut van Cytofast met Flowsom en cytosplore wordt getoond. Cytofast genereert snel visuele representaties van groepgerelateerde immuuncelclusters en correlaties met de samenstelling van het immuunsysteem. Verschillen worden waargenomen in de clusteranalyse, maar scheiding tussen groepen zijn zichtbaar met beide cluster methoden. Cytofast toont visueel de patronen geïnduceerd door PD-L1-behandeling die een hogere overvloed aan geactiveerde NK-celsubsets bevatten, waarbij een hogere intensiteit van activerings markers wordt uitgesproken (d.w.z. CD54 of CD11c).
Introduction
Massa cytometrie (cytometrie door tijd-van-vlucht, of CyTOF) maakt detectie van een breed scala van intracellulaire of extracellulaire biomarkers in miljoenen afzonderlijke cellen. De High-dimensionale aard van Mass cytometrie gegevens vereist bepaalde analysetools, zoals celclustering technieken zoals SPADE1, flowmaps2, flowsom3, phenograph4, VorteX5en steiger Maps6. Daarnaast zijn er verschillende technieken voor dimensionaliteit reductie ontwikkeld (d.w.z. hoofdcomponent analyse [PCA]7, t-Distributed stochastische buurman insluiten [t-SNE]8, hiërarchische stochastische neighbor Embedding [hsne]9, uniforme variëteit benadering en projectie [umap]10, en diffusie kaarten11) om de snelheid, interpretatie en visualisatie van High-dimensionale gegevenssets te verbeteren.
Downstreamanalyse van High-dimensionale flow en Mass cytometrische gegevens mist vaak automatische processen om statistische tests uit te voeren op cluster frequentie en koppelingen met klinische uitkomsten. Voorheen ontwikkelden we een R-gebaseerde workflow, bekend als Cytofast12, die visuele en kwantitatieve stroomafwaartse analyses van clustering technieken mogelijk maakt door Cytosplore of flowsom.
Het hier beschreven protocol verduidelijkt het gebruik van Cytofast in R en laat zien hoe kwantitatieve en kwalitatieve Heatmaps en grafieken te genereren. Bovendien vergemakkelijkt het de bepaling van verbindingen tussen waargenomen immuunfenotypes en klinische uitkomsten. Dit rapport beschrijft ook de analyse van een specifieke massa-cytometrie-gegevensset met behulp van twee verschillende clustering procedures: Flowsom en cytosplore. Door Cytofast te gebruiken met beide cluster methoden, is het dienovereenkomstig aangetoond dat het activerings fenotype van NK-cellen wordt beïnvloed door PD-L1 immune Checkpoint blokkade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytofast is een snelle computationele tool die een snelle en wereldwijde verkenning van cytometrische gegevens biedt door het markeren en kwantificeren van behandelings specifieke cellulaire subsets. Het beschreven protocol is bedoeld om clustering analyses verder te verwerken met Cytosplore of flowsom. Andere clustering analysetools zijn geschikt voor cytofast, maar dit vereist het gebruik van cytofast om elke cel aan een subset toe te wijzen. Cytofastis echter geen cluster methode en vereist daarom voor gebruik clustering procedures.
De hier uitgevoerde analyse toonde aan dat bepaalde CD161+ NK-celsubgroepen in de tumor-micro omgeving gevoelig waren voor een PD-L1-blokkade. Dit werd bewezen door veranderingen in hun fenotype en overvloed, die werden waargenomen met behulp van zowel Cytosplore als flowsom als clustering methoden. Beide methoden onderscheiden de belangrijkste NK-celclusters (CD11b+ NKG2A+) met iets verschillende frequenties (15% – 20% voor cytosplore, 30% – 40% voor flowsom). De verschillen in overvloed en deze benadering hebben geen invloed op het globale patroon, omdat beide dendrogrammen weergegeven in de rechter panelen van Figuur 2 en Figuur 3 vergelijkbare resultaten vertoonden. Door Cytofastte gebruiken, is het dus mogelijk (onafhankelijk van de gekozen cluster methode) om PD-L1-behandelde en onbehandelde muizen te scheiden op basis van analyses van de NK-celcluster fenotype en overvloed.
Afhankelijk van de vastgelegde parameters zijn wijzigingen aan het protocol nodig. Bepaalde parameters zoals tijd en achtergrond moeten worden verwijderd tijdens het uitvoeren van de clusteranalyse. Bovendien is het belangrijk dat elke cel aan een subset wordt toegewezen. De functie cfData voegt eenvoudigweg het aantal ruwe cellen per cluster per sample toe aan de cfList. Vanuit deze stap kan de cytoheatmap worden gebouwd zoals uitgelegd in sectie 3.
Cytofast is met succes gebruikt als visualisatie-en kwantificerings tool om verschillende clustering methoden te vergelijken13. Dit R-pakket is ook compatibel met geavanceerde functies, zoals de globaltest14, die associaties kan testen tussen groepen clusters met behulp van klinische variabelen. In de toekomst kunnen de globaltest tool en andere algoritmen worden geïntegreerd met cytofast voor meer diepgaande visualisatie en kwantificering.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen de financiering van de Europese Commissie van een H2020 MSCA Award onder het voorstel nummer 675743 (ISPIC). Wij danken Tetje van der sluis en Iris Pardieck voor het testen van het protocol.
References
- Anchang, B., et al. Visualization and cellular hierarchy inference of single-cell data using SPADE. Nature Protocols. 11 (7), 1264-1279 (2016).
- Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16 (3), 323-337 (2015).
- Van Gassen, S., et al. FlowSOM: Using self-organizing maps for visualization and interpretation of cytometry data. Cytometry A. 87 (7), 636-645 (2015).
- Levine, J. H., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13 (6), 493-496 (2016).
- Spitzer, M. H., et al. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425 (2015).
- Hotelling, H. Analysis of a complex of statistical variables into principal components. Journal of Educational Psychology. 24 (6), 417-441 (1933).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing Data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. , (2008).
- Pezzotti, N., Hollt, T., Lelieveldt, B., Eisemann, E., Vilanova, A. Hierarchical Stochastic Neighbor Embedding. Computer Graphics Forum. 35 (3), 21-30 (2016).
- Becht, E., et al. Dimensionality reduction for visualizing single-cell data using UMAP. Nature Biotechnology. 37, 38 (2018).
- Haghverdi, L., Buettner, F., Theis, F. J. Diffusion maps for high-dimensional single-cell analysis of differentiation data. Bioinformatics. 31 (18), 2989-2998 (2015).
- Beyrend, G., Stam, K., Höllt, T., Ossendorp, F., Arens, R. Cytofast: A workflow for visual and quantitative analysis of flow and mass cytometry data to discover immune signatures and correlations. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 435-442 (2018).
- Beyrend, G., et al. PD-L1 blockade engages tumor-infiltrating lymphocytes to co-express targetable activating and inhibitory receptors. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7 (1), 217 (2019).
- Goeman, J. J., van de Geer, S. A., de Kort, F., van Houwelingen, H. C. A global test for groups of genes: testing association with a clinical outcome. Bioinformatics. 20 (1), 93-99 (2004).
