הדמיה וכימות של מידע רב-מימדי באמצעות ציטומהר ושיטות התקבצות של הזרם
Summary
ציטומהיר הוא כלי חזותי המשמש לניתוח פלט מתוך קיבוץ באשכולות. ציטומהיר ניתן להשתמש כדי להשוות שתי שיטות באשכולות: Flowsom ו ציטושינור. ציטומהיר יכול ליצור במהירות סקירה כמותית ואיכותית של הנתונים cy, לנסות המוני ולהדגיש את ההבדלים העיקריים בין אלגוריתמים שונים באשכולות.
Abstract
המורכבות של הנתונים שנוצרו על-ידי cy, try המונית המחייב כלים חדשים להמחיש במהירות תוצאות אנליטיות. שיטות התקבצות כמו ציטושלנור או flowsom משמשות להדמיה וזיהוי של אשכולות תאים. עבור ניתוח במורד הזרם, חבילת R שפותחה לאחרונה, ציטומהיר, יכול ליצור הדמיה מהירה של תוצאות משיטות התקבצות. ציטומהר לוקח בחשבון את האפיון פנוטילי של אשכולות תאים, מחשב את שפע אשכול התא, ולאחר מכן כימות השוואת קבוצות. פרוטוקול זה מסביר את היישומים של ציטומהיר כדי להשתמש cy, לנסות המוני נתונים מבוסס על אפנון של מערכת החיסון בסביבת מיקרו הגידול (כלומר, הרוצח הטבעי [NK] התגובה התא) על אתגר הגידול ואחריו חיסוני (PD-L1 המצור). הפגנה של השימושיות של ציטומהיר עם Flowsom ו ציטובין מוצג. ציטומיהיר במהירות יוצר ייצוגים חזותיים של קבוצות הקשורות לקבוצה של אשכולות התא החיסונית עם הרכב המערכת החיסונית. הבדלים מוצגים בניתוח האשכולות, אך הפרדה בין קבוצות גלויה עם שתי שיטות האשכול. ציטוהיר ויזואלי מראה את דפוסי הנגרמת על ידי הטיפול PD-L1 הכוללים שפע גבוה יותר של קבוצות מערכות מופעלות של תא NK, המבטא עוצמה גבוהה יותר של סמני הפעלה (כלומר, CD54 או CD11c).
Introduction
Cy, המוני הסיילנסה (cy, לנסות לפי זמן הטיסה, או Cyתוף) מאפשר זיהוי של מגוון רחב של בסמנים תאיים או מסחטות במיליוני תאים בודדים. האופי הרב מימדי של הנתונים cyPhenograph try ההמוני מחייבת כלי ניתוח מסוימים, כגון טכניקות באשכולות תא כמו עלה1, flowmaps2, flowmaps3, 4, מערבולת5, ו מפות הגרדום6. בנוסף, פותחו טכניקות מבוססות מימדית שונות (כלומר, ניתוח המרכיב העיקרי [PCA]7, t-הפצת שכנה סטוכסטי שכנים [t-sne]8, היררכי הטמעה סטוכסטי שכנים [hsne]9, הקירוב סעפת אחיד והקרנה [umap]10, ו דיפוזיה מפות11) כדי לשפר את המהירות, פרשנות ויזואליזציה של מימדי high-
ניתוח במורד הזרם של זרימה גבוהה ונתונים cy, המוניים לעתים קרובות חסרים תהליכים אוטומטיים כדי לבצע בדיקות סטטיסטיות על תדר אשכולות וקישורים עם תוצאות קליניות. בעבר, פיתחנו זרימת עבודה מבוססת R המכונה ציטוfast12, אשר מאפשר ניתוח ויזואלי כמותי למטה של טכניקות התקבצות על ידי ציטומאגור או flowsom.
הפרוטוקול המתואר כאן מבהיר את השימוש בציטוצום ב R ומראה כיצד ליצור מפות חום כמותיים ואיכותניות. יתרה מזאת, היא מקלה על קביעת הקשרים בין הפנוטיפים החיסונית ותוצאות קליניות. בנוסף, דוח זה מתאר את הניתוח של ערכת נתונים מוגדרת של cy, המסה באמצעות שתי הליכי באשכולות שונים: Flowsom וציטוספיטור. באמצעות ציטומהיר עם שתי שיטות האשכול, זה בהתאמה מראה כי הפעלת פנוטיפ של תאים NK מושפע PD-L1 הסגר המחסום החיסון.
Protocol
Representative Results
Discussion
ציטומהיר הוא כלי חישוביות מהירה המספקת חקר מהיר וגלובלי של נתונים ציטומטוניים על ידי הדגשת וכימות מערכות מידע סלולריות ספציפיות לטיפול. הפרוטוקול תיאר מטרתו להמשיך ולנתח את האשכולות עם ציטוספינור או flowsom. כלי ניתוח אחרים באשכולות מתאימים לציטומהיר, אך הדבר דורש את השימוש בציטומהיר כדי להקצות כל תא לקבוצת משנה. ציטוfast, עם זאת, אינו שיטת קיבוץ באשכולות, ולכן דורש הליכי קיבוץ באשכולות לפני השימוש.
הניתוח שבוצע כאן הראה כי מסוימים CD161+ מערכות המשנה של תא בסביבת מיקרו הגידול היו רגישות למצור PD-L1. זה נצפה על ידי שינויים הפנוטיפים שלהם ושפע, אשר נצפו באמצעות שני ציטוסם ו flowsom כמו שיטות באשכולות. שתי השיטות להבדיל את האשכול העיקרי של התא NK (CD11b+ NKG2A+) עם תדרים שונים במקצת (15%-20% עבור הציטומאגור, 30% – 40% עבור flowsom). ההבדלים בשפע וקירוב זה לא השפיעו על התבנית הגלובלית, משום ששתי הגיגרמות מוצגות בלוחות הנכונות של הדמות 2 ובאיור 3 הראו תוצאות דומות. באמצעות ציטומהיר, כך ניתן (בלתי תלוי בשיטת התקבצות שנבחרה) לL1-PD-מטופלים ועכברים שטופלו על בסיס ניתוחים של האשכול של תא NK ושפע.
בהתאם לפרמטרים שנרשמו, יש צורך בשינויים בפרוטוקול. באופן ספציפי, יש להסיר פרמטרים מסוימים כגון זמן ורקע בעת ביצוע ניתוח האשכולות. בנוסף, חשוב שכל תא יוקצה לקבוצת משנה. הפונקציה cfData פשוט תוסיף את ספירת התא הגולמי לכל אשכול לכל מדגם לתוך Cfdata. משלב זה ניתן לבנות את מפת הציטוחום כמוסבר בסעיף 3.
ציטומהר כבר נעשה שימוש בהצלחה ככלי הדמיה וכימות להשוואת שיטות שונות באשכולות13. חבילת R זו תואמת גם לתכונות מתקדמות, כגון המבחן הגלובלי14, אשר יכול לבדוק שיוכים בין קבוצות של אשכולות באמצעות משתנים קליניים. בעתיד, ניתן לשלב את הכלי הגלובלי והאלגוריתמים האחרים באמצעות ציטומהיר לצורך הדמיה וכימות מעמיקה יותר.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים במימון הנציבות האירופית לפרס H2020 MSCA לפי הצעה מספר 675743 (Iהיספאני). אנו מודים לטיטג’ה ואן דר סלואן ואיריס פארנק על בחינת הפרוטוקול.
References
- Anchang, B., et al. Visualization and cellular hierarchy inference of single-cell data using SPADE. Nature Protocols. 11 (7), 1264-1279 (2016).
- Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16 (3), 323-337 (2015).
- Van Gassen, S., et al. FlowSOM: Using self-organizing maps for visualization and interpretation of cytometry data. Cytometry A. 87 (7), 636-645 (2015).
- Levine, J. H., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13 (6), 493-496 (2016).
- Spitzer, M. H., et al. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425 (2015).
- Hotelling, H. Analysis of a complex of statistical variables into principal components. Journal of Educational Psychology. 24 (6), 417-441 (1933).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing Data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. , (2008).
- Pezzotti, N., Hollt, T., Lelieveldt, B., Eisemann, E., Vilanova, A. Hierarchical Stochastic Neighbor Embedding. Computer Graphics Forum. 35 (3), 21-30 (2016).
- Becht, E., et al. Dimensionality reduction for visualizing single-cell data using UMAP. Nature Biotechnology. 37, 38 (2018).
- Haghverdi, L., Buettner, F., Theis, F. J. Diffusion maps for high-dimensional single-cell analysis of differentiation data. Bioinformatics. 31 (18), 2989-2998 (2015).
- Beyrend, G., Stam, K., Höllt, T., Ossendorp, F., Arens, R. Cytofast: A workflow for visual and quantitative analysis of flow and mass cytometry data to discover immune signatures and correlations. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 435-442 (2018).
- Beyrend, G., et al. PD-L1 blockade engages tumor-infiltrating lymphocytes to co-express targetable activating and inhibitory receptors. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7 (1), 217 (2019).
- Goeman, J. J., van de Geer, S. A., de Kort, F., van Houwelingen, H. C. A global test for groups of genes: testing association with a clinical outcome. Bioinformatics. 20 (1), 93-99 (2004).
