في الوقت الحقيقي التصوير الضوئي التلالؤ من الدرجة ديناميات الإشارات اثناء التكوين العصبي Murine
Summary
الجذعية العصبية/الخلايا progenitor يحمل ديناميات التعبير المختلفة من الشق يشير المكونات التي تؤدي إلى نتائج مختلفه من الاحداث الخلوية. ويمكن الكشف عن مثل هذا التعبير الديناميكي عن طريق الرصد في الوقت الحقيقي ، وليس عن طريق التحليل الساكن ، وذلك باستخدام نظام تصويري حساس للغاية للتصوير الضوئي يمكن من تصور التغيرات السريعة في تعابير الجينات.
Abstract
الشق الإشارات ينظم صيانة الخلايا الجذعية العصبية/السلف بواسطة التفاعلات خليه الخلية. مكونات اشاره الشق تظهر تعبير ديناميكي. يتم التعبير عن الشق اشاره Hes1 والشق يجند like1 (Dll1) بطريقه التذبذب في الخلايا الجذعية العصبية/progenitor. لان الفترة من التعبير يتذبذب من هذا مورثات جدا قصيرة (2 [ه]), هو يصعب ان يراقب هم دوريه تعبير. لفحص هذه التغيرات السريعة في التعبير الجيني أو ديناميات البروتين ، مطلوب مراسلي الاستجابة السريعة. وبسبب حركيه النضوج السريع والحساسية العالية ، فان المراسل لوسيفيرياز البيولوجي هو المناسب لرصد التغيرات السريعة في التعبير الجيني في الخلايا الحية. استخدمنا مراسلا لمراقبه النشاط المروج والمراسل المنصهر لإظهار ديناميكية البروتين عند دقه الخلية الواحدة. يظهر هذا مراسلات [بيوميننس] دوران سريعة ويلد إشارات ضعيفه جدا; لذلك ، قمنا بتطوير نظام التصوير الضوئي الحساس للغاية للكشف عن مثل هذه الإشارات الخافتة. هذه الطرق تمكننا من رصد مختلف ديناميات التعبير الجيني في الخلايا الحية والانسجه ، والتي هي معلومات هامه للمساعدة في فهم الدول الخلوية الفعلية.
Introduction
ويتكون الدماغ الثدييات من عدد كبير من أنواع مختلفه من الخلايا العصبية والكريات الدليج. يتم إنشاء جميع الخلايا من الجذعية العصبية/الخلايا progenitor (npcs) ، والتي تتكاثر أولا لتوسيع اعدادهم ، ثم البدء في التفريق في الخلايا العصبية ، وأخيرا التي تؤدي إلى زنزانات الدبقيه1،2،3،4،5. مره واحده وقد تميزت الخلايا في الخلية العصبية ، فانها لا يمكن ان تتكاثر أو زيادة اعدادهم ، التالي ، وصيانة NPCs حتى مراحل لاحقه أمر مهم. الشق يشير عن طريق التفاعلات خليه خليه يلعب دورا هاما في الحفاظ علي npcs6،7. الشق يغاندس تتفاعل مع البروتين الغشاء ، الشق ، علي سطح الخلايا المجاورة وينشط البروتين الشق. بعد التنشيط ، يحدث التحلل البروتيني من البروتين الشق ، التالي الإفراج عن المجال داخل الخلايا من الشق (nicd) من غشاء الخلية في نواه8،9،10. في النواة ، يرتبط NICD بالمناطق المروجة لHes1 و Hes5 (Hes1/5) وينشط التعبير عن هذه الجينات. Hes1/5 قمع التعبير عن الجينات proneural Ascl1 و Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. لان الجينات proneural تحفز التمايز العصبية ، Hes1/5 تلعب أدوارا أساسيه في الحفاظ علي أجهزه الكمبيوتر الشخصية. وعلاوة علي ذلك ، كما الجينات proneural يمكن تفعيل التعبير من الشق ودلتا-like1 (Dll1) ، Hes1/5 أيضا قمع التعبير عن Dll1. ولذلك ، فان التعبير عن Dll1 يؤدي إلى الخلايا المجاورة السلبية ل Dll1 عن طريق اشاره الشق. وبهذه الطريقة ، تمنع الخلايا الخلايا المجاورة من اتباع مصيرها نفسه ، وهي ظاهره تعرف باسم التثبيط الجانبي8. في الدماغ النامية ، وتثبيط الجانبي يلعب دورا في توليد مختلف أنواع الخلايا المختلفة.
التصوير في الوقت الحقيقي علي مستوي خليه واحده يكشف عن تعبيرات ديناميكية من مكونات الإشارات الشق في npcs15،16،17. الشق يشير ينشط التعبير عن Hes1، ولكن Hes1 البروتين يربط إلى المروج الخاصة به ويقمع التعبير الخاصة به. وعلاوة علي ذلك ، Hes1 هو بروتين غير مستقر للغاية ، والتي يتم المتدهورة من قبل المسار اوبيكويتين-بروتياسومي ؛ ولذلك ، فان قمع المروج الخاصة به قصيرة فقط عاش ومن ثم يبدا النسخ مره أخرى. بهذه الطريقة ، والتعبير عن Hes1 يتذبذب في كل من النسخ والمستويات الانتقالية في دوره 2 ح18. ويؤدي التعبير المتذبذب لHes1 ، بدوره ، إلى التعبير المتذبذب عن الجينات المستهدفة المصب ، مثل الAscl1والNeurog2 والDll1 ، عن طريق القمع الدوري15و16و17و19. بينما الجينات proneural يمكن ان تحفز التمايز العصبية, التعبير الذبذبات غير كافيه لتمايز الخلايا العصبية; بدلا من ذلك التعبير المستدام ضروري لتمايز الخلايا العصبية. التعبير المتذبذب من الجينات proneural مهم للحفاظ علي npcs بدلا من حفز التمايز العصبية14,15,16. التعبير عن Dll1 يتذبذب في كل من النسخ والمستويات الانتقالية خلال التكوينات المختلفة ، مثل تكوين الأعصاب والسمية. التعبير الديناميكي لل Dll1 هو المهم لتكوين المستنقعات العادية والتعبير الثابت من Dll1 يدفع العيوب في التكوين العصبي والتمدد17. وتبين هذه النتائج الوظيفة الهامه التي تقوم بها ديناميات التعبير الجيني وحركيه البروتين علي تنظيم مختلف الاحداث التنموية (اي ان ديناميات التعبير المختلفة تنتج مخرجات مختلفه في السلوكيات الخلوية).
لتحليل ديناميات الإشارات الشق ، وتحليل ثابت من الانسجه والخلايا غير كافيه لأنها تتغير باستمرار. التصوير في الوقت الحقيقي من خلايا واحده هو أداه قويه للكشف عن ديناميات في التعبير الجيني. التعبير الديناميكي لجزيئات اشاره الشق الخضوع لاستجابات دوريه سريعة في الفترة من 2-3 h. ويمثل هذا التعبير الدوري السريع مشكلتين صعبتين للرصد في الوقت الحقيقي: (1) يتم قمع التعبير عن الجزيئات إلى مستويات منخفضه ، و (2) دوران السريع يتطلب مراسلين سريع الاستجابة. للتغلب علي هذه المشاكل ، قمنا مسبقا بتطوير طريقه التصوير في الوقت الحقيقي التلالؤ20. لان الصحفي الحيوي لديه حساسية اعلي ووقت النضج أقصر من الصحفيين الفلورسنت ، وهذه الاستراتيجية تمكننا من مراقبه الديناميكيات السريعة في الخلايا الحية. باستخدام التصور في الوقت الحقيقي ، وجدنا ان المزيد من الجينات أظهرت تعبيرا ديناميكيا مما كنا نظن سابقا. الاضافه إلى ذلك ، ازداد عدد التقارير التي تبين ديناميات التعبير والبروتين في الخلايا الحية واهميه هذه الديناميات في مختلف الاحداث البيولوجية ، مما يوحي بدور أساسي لديناميات تعابير الجينات21و22.
في هذا التقرير ، ونحن وصف طريقه لتصور التعبير عن الشق يجند Dll1 في npcs في كل من الثقافات المنفصلة وفي الثقافات شريحة القشرية. لمراقبه ديناميات Dll1 النسخ علي مستويات خليه واحده ، ونحن ولدت الثقافات المنفصلة من npcs المستمدة من الدماغ الجنيني من الفئران المعدلة وراثيا التي تحمل مراسل PDll1-Ub-fluc ، وهو Dll1 المروج الذي يحركها المؤيد الذي زعزعه استقراره. لمراقبه ديناميات البروتين Dll1 في الجسم الحيوي ، قدمنا Dll1 مراسل الانصهار في NPCs في القشرة وتصور التعبير عن مراسل في NPCs في الثقافات شريحة القشرية. التصوير في الوقت الحقيقي مكننا من التقاط الخصائص المختلفة للتعبير الجيني وديناميكيات البروتين في الخلايا الحية في الدقة الزمنيه العالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
مكونات الإشارات الشق تظهر التعبيرات المتذبذبة في التزامن اثناء التوالد ولكن من التزامن اثناء التكوين العصبي ، مما يؤدي إلى صعوبات في التقاط ديناميات التعبير عن طريق تحليل ثابت في الحالة الاخيره. التالي ، مطلوب رصد في الوقت الحقيقي للكشف عن ديناميات التعبير من مكونات الإشارات الشق ، مثل <e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر يوميكو ايواموتو لدعم إنتاج الفيديو. ونحن ممتنون أيضا ل Akihiro ايسومورا لمناقشه ودعم تحليل الصور ، هيتوشي Miyachi لدعم التقنية لتوليد الكائنات المحورة وراثيا ، يوجي Shinjo (اوليمبوس العلوم الطبية) ، ماساتوشي غوته (اوليمبوس العلوم الطبية) ، تاكانيا ايميزو ( اوليمبوس العلوم الطبية) و Ouin Kunitaki (Andor اليابان) للحصول علي الدعم الفني والمناقشات من نظام التصوير الإحيائي. وقد دعم هذا العمل من قبل البحوث الاساسيه للعلوم والتكنولوجيا التطورية (JPMJCR12W2) (R.K.) ، والمنح في المعونة للبحوث العلمية في مجالات مبتكره (تربيه 24116705 لH.S. و تربيه 16H06480 ل R.K.) ، ومنحه المعونة للبحوث العلمية (ج) (JSPS 18K06254) (H.S.) ، مؤسسه تاكيدا (R.K. و H.S.) ، ومنصة للنهج الديناميكية لنظام المعيشة من وزاره التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا ، اليابان.
Materials
| Bioluminescence Imaging System | |||
| Chilled water circulator (chiller) | Julabo | Model: F12-ED | |
| Cooled CCD camera | Andor Technology | Model: iKon-M 934 | |
| Incubator system | TOKAI HIT | Model: INU-ONICS | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX81 | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX83 | |
| LED illumination device | CoolLED | Model: pE1 | |
| MetaMorph | MOLECULAR DEVICES | Model: 40000 | |
| Mix gas controller | Tokken | Model: TK-MIGM OLO2 | |
| Objective lens | Olympus | Model: UPLFLN 40X O | |
| Preparations for Dissection | |||
| Dissection microscope | Nikon | Model: SMZ-2B | |
| Fluorescence stereoscopic microscope | Leica | Model: MZ16FA | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Scissors, Micro scissors | |||
| Forceps | |||
| Ring-shaped forceps | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Reagents for NPC dissociation culture | |||
| B27 supplement | invitrogen | 12587-010 | |
| bFGF | invitrogen | 13256-029 | Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS |
| D-luciferin | Nacalai Tesque | 01493-85 | Stock solution: 100mM in 0.9% saline |
| DNase | Worthington Biochemical Corporation | LK003172 | Stock solution: 1000U/ml in EBSS |
| EBSS | Worthington Biochemical Corporation | LK003188 | |
| Glass bottom dish | IWAKI | 3910-035 | |
| N2 supplement (100x) | invitrogen | 17502-048 | |
| N-acetyl-cystein | Sigma | A-9165-25G | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LK003178 | Stock solution: 7U/ml in EBSS |
| Penicillin/Streptmycine | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P-6281 | 40 mg/ml in DW |
| Preparations for in utero electroporation | |||
| 50-ml syringe | TERUMO | 181228T | |
| Electrode | Neppagene | 7-mm | |
| Electroporator | Neppagene | CUY21 EDIT | |
| Forceps | |||
| Gauzes | Kawamoto co. | 7161 | |
| Micro capillary | Made in-house | ||
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Pentbarbital | Kyoritsuseiyaku | Somnopentyl | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Suture needle | Akiyama MEDICAL MFG. CO | F17-40B2 | |
| Xylazine | Bayer | Seractal | |
| Preparations for Slice culture | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| Culture insert | Millipore | PICM01250 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012-500ML | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Forceps | |||
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Micro surgical knife | Alcon | 19 Gauge V-Lance | |
| Multi-gas incubator | Panasonic | MCO-5MUV-PJ | |
| N2/B27 media | Made in-house | ref. NPC dissociatioin culture | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Silicon rubber cutting board | Made in-house |
References
- Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
- Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Paridaen, J. T., Huttner, W. B. Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system. EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. Notch signaling in vertebrate neural development. Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).
- Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks. Neuron. 69, 840-855 (2011).
- Bray, S. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
- Bray, S. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).
- Kopan, R., Ilagan, M. X. G. The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism. Cell. 137, 216-233 (2009).
- Ishibashi, M., et al. Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system. The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).
- Ohtsuka, T., et al. Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation. The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).
- Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain. Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).
- Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis. Development. 134, 1243-1251 (2007).
- Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors. Neuron. 58, 52-64 (2008).
- Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Shimojo, H., et al. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes and Development. 30, 102-116 (2016).
- Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
- Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition. Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).
- Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).
- Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342, 1193-1200 (2013).
- Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152, 945-956 (2013).
- Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice. Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).
- Yamaguchi, S., et al. Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
- Kiyohara, Y. B., et al. The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).
- Behar, M., Hoffmann, A. Understanding the temporal codes of intra-cellular signals. Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic Gene Expression in a Single Cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
- Nelson, D. E., et al. Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression. Science. 306, 704-708 (2004).
- Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
- Hansen, A. S., O’Shea, E. K. Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression. Molecular Systems Biology. 9, 704 (2014).
- Hansen, A. S., O’Shea, E. K. cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale. Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).
- Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo. Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).
- Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: Progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
- Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay. Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).
- Nakajima, Y., et al. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, (2010).
- Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12, (2013).
