Echtzeit-Biolumineszenz-Bildgebung der Notch-Signaldynamik während der murinen Neurogenese

Das Säugetiergehirn besteht aus einer großen Anzahl von verschiedenen Arten von Neuronen und Gliazellen. Alle Zellen werden aus neuronalen Stamm-/Vorläuferzellen (NPCs) erzeugt, die sich zuerst vermehren, um ihre Anzahl zu erweitern, dann beginnen, sich in Neuronen zu differenzieren, und schließlich zu Gliazellen^1,2,3,4,5führen. Sobald sich die Zellen in Neuronen differenziert haben, können sie sich nicht vermehren oder ihre Anzahl erhöhen, und daher ist die Aufrechterhaltung von NPCs bis zu späteren Stadien wichtig. Die Notch-Signalisierung über Zell-Zell-Interaktionen spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der NPCs^6,7. Kerbliganden interagieren mit dem Membranprotein Notch auf der Oberfläche benachbarter Zellen und aktivieren das Kerbprotein. Nach der Aktivierung tritt eine Proteolyse des Kerbproteins auf, wodurch die intrazelluläre Domäne von Notch (NICD) aus der Zellmembran in den Zellkern^8,9,10freigesetzt wird. Im Kern bindet NICD an die Förderregionen Hes1 und Hes5 (Hes1/5) und aktiviert die Expression dieser Gene. Hes1/5 unterdrücken die Expression der proneuralen Gene Ascl1 und Neurogenin1/2 (Neurog1/2)^11,12,13,14. Da proneurale Gene neuronale Differenzierung induzieren, spielen Hes1/5 eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung von NPCs. Da proneurale Gene die Expression des Kerbliganden Delta-like1 (Dll1) aktivieren können, reprimiert Hes1/5 auch die Expression von Dll1. Daher führt die Expression von Dll1 dazu, dass benachbarte Zellen für Dll1 über Notch-Signalisierung negativ sind. Auf diese Weise hemmen Zellen benachbarte Zellen daran, ihrem gleichen Schicksal zu folgen, ein Phänomen, das als laterale Hemmung bekannt ist⁸. Im sich entwickelnden Gehirn spielt die laterale Hemmung eine Rolle bei der Erzeugung verschiedener Zelltypen.

Die Echtzeit-Bildgebung auf Einzelzellebene zeigt dynamische Ausdrücke der Komponenten der Notch-Signalisierung in NPCs^15,16,17. Notch Signalisierung aktiviert die Expression von Hes1, aber Hes1 Protein bindet an seinen eigenen Promotor und unterdrückt seinen eigenen Ausdruck. Darüber hinaus ist Hes1 ein extrem instabiles Protein, das durch den Ubiquitin-Proteasomen-Weg abgebaut wird; Daher ist die Repression des eigenen Förderers nur von kurzer Dauer und dann beginnt die Transkription wieder. Auf diese Weise oszilliert der Ausdruck von Hes1 sowohl auf der Transkriptions- als auch auf der Translationsebene in einem 2 h-Zyklus¹⁸. Die oszillierende Expression von Hes1 wiederum induziert die oszillierende Expression der nachgeschalteten Zielgene, wie Ascl1, Neurog2 und Dll1, durch periodische Repression^15,16,17,19. Während proneurale Gene neuronale Differenzierung induzieren können, reicht ihre oszillierende Expression für eine neuronale Differenzierung nicht aus; vielmehr ist ihr nachhaltiger Ausdruck für die neuronale Differenzierung unerlässlich. Die oszillatorische Expression von proneuralen Genen ist wichtig für die Aufrechterhaltung von NPCs und nicht für die Induktion neuronaler Differenzierung^14,15,16. Die Expression von Dll1 oszilliert sowohl auf Transkriptions- als auch auf Translationsebene während verschiedener Morphogenese, wie Neurogenese und Somitogenese. Die dynamische Expression von Dll1 ist wichtig für die normale Morphogenese und die stetige Expression von Dll1 induziert Defekte in der Neurogenese und Sogenese¹⁷. Diese Ergebnisse zeigen die wichtige Funktion, die die Dynamik der Genexpression und Proteinkinetik auf die Regulation verschiedener Entwicklungsereignisse hat (d.h. unterschiedliche Expressionsdynamiken erzeugen unterschiedliche Outputs im zellulären Verhalten).

Um die Dynamik der Notch-Signalisierung zu analysieren, reicht die statische Analyse von Geweben und Zellen nicht aus, da sie sich ständig ändern. Die Echtzeit-Bildgebung einzelner Zellen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Dynamik in der Genexpression zu offenbaren. Die dynamische Expression von Notch-Signalmolekülen erfährt im Zeitraum von 2-3 h schnelle zyklische Reaktionen. Diese schnelle periodische Expression stellt die Echtzeitüberwachung vor zwei schwierige Probleme: (1) Die Expression der Moleküle wird auf ein niedriges Niveau unterdrückt, und (2) ein schneller Fluktuation erfordert schnell reagierende Reporter. Um diese Probleme zu überwinden, haben wir zuvor eine Biolumineszenz-Echtzeit-Bildgebungsmethode²⁰entwickelt. Da der Biolumineszenzreporter eine höhere Empfindlichkeit und kürzere Reifezeit hat als fluoreszierende Reporter, ermöglicht uns diese Strategie, die schnelle Dynamik in lebenden Zellen zu überwachen. Anhand der Echtzeit-Visualisierung stellten wir fest, dass mehr Gene eine dynamische Expression aufwiesen, als wir bisher dachten. Darüber hinaus hat die Zahl der Berichte, die Expression und Proteindynamik in lebenden Zellen und die Bedeutung dieser Dynamik in verschiedenen biologischen Ereignissen zeigen, zugenommen, was auf eine grundlegende Rolle der Dynamik in den Genausdrücken^21,22hindeutet.

In diesem Bericht beschreiben wir eine Möglichkeit, den Ausdruck der Kerb Liganden Dll1 in NPCs sowohl in dissoziierten Kulturen als auch in kortikalen Scheibenkulturen zu visualisieren. Um die Dynamik der Dll1-Transkription auf Einzelzellebenen zu überwachen, erzeugten wir dissoziierte Kulturen von NPCs, die aus dem embryonalen Telencephalon von transgenen Mäusen abgeleitet wurden, die pDll1-Ub-Fluc-Reporter trugen, einen Dll1-Promotor-gesteuerten destabilisierten Luziferase-Reporter. Um die Dll1-Proteindynamik in vivo zu überwachen, führten wir den Dll1-Fluc-Fusionsreporter in NPCs im Kortex ein und visualisierten den Ausdruck des Reporters in NPCs in kortikalen Scheibenkulturen. Die Echtzeit-Bildgebung ermöglichte es uns, die verschiedenen Merkmale der Genexpression und Proteindynamik in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher Auflösung zu erfassen.