Imagerie en temps réel de bioluminescence de la dynamique de signalisation d'encoche pendant la neurogenèse de Murine

Le cerveau des mammifères est composé d’un grand nombre de différents types de neurones et de cellules gliales. Toutes les cellules sont générées à partir de cellules neurales souches/progénitrices (PNJ), qui prolifèrent d’abord pour augmenter leur nombre, puis commencent à se différencier en neurones, et finalement donner naissance à des cellules gliales^1,2,3,4,5. Une fois que les cellules se sont différenciées en neurones, elles ne peuvent pas proliférer ou augmenter leur nombre, et, par conséquent, le maintien des PNJ jusqu’à des stades ultérieurs est important. La signalisation d’entaille par l’intermédiaire des interactions cellule-cellule joue un rôle important en maintenant des PNJ^6,7. Les ligands d’entaille interagissent avec la protéine membranaire, Notch, à la surface des cellules voisines et activent la protéine Notch. Après l’activation, la protéolyse de la protéine Notch se produit, libérant ainsi le domaine intracellulaire de Notch (NICD) de la membrane cellulaire dans le noyau^8,9,10. Dans le noyau, NICD se lie aux régions promotrices de Hes1 et Hes5 (Hes1/5) et active l’expression de ces gènes. Hes1/5 réprimer l’expression des gènes proneural Ascl1 et Neurogenin1 /2 (Neurog1/2)^11,12,13,14. Puisque les gènes proneural induisent la différenciation neuronale, Hes1/5 jouent des rôles essentiels en maintenant des PNJ. En outre, comme les gènes proneural peuvent activer l’expression de la Notch ligand Delta-like1 (Dll1), Hes1/5 également réprimer l’expression de Dll1. Par conséquent, l’expression de Dll1 conduit à des cellules voisines étant négative pour Dll1 via Notch signalisation. De cette façon, les cellules inhibent les cellules adjacentes de suivre leur même sort, un phénomène connu sous le nom d’inhibition latérale⁸. Dans le cerveau en développement, l’inhibition latérale joue un rôle dans la génération de différents types de cellules.

L’imagerie en temps réel au niveau des cellules individuelles révèle des expressions dynamiques des composants de la signalisation Notch dans les PNJ^15,16,17. La signalisation d’encoche active l’expression de Hes1, mais la protéine Hes1 se lie à son propre promoteur et réprime sa propre expression. En outre, Hes1 est une protéine extrêmement instable, qui est dégradée par la voie ubiquitine-protéasome ; par conséquent, la répression de son propre promoteur n’est que de courte durée et la transcription recommence. De cette façon, l’expression de Hes1 oscille à la fois au niveau de la transcription et de la traduction dans un cycle de 2 h¹⁸. L’expression oscillatoire de Hes1, à son tour, induit l’expression oscillatoire des gènes cibles en aval, tels que Ascl1, Neurog2, et Dll1, par la répression périodique^15,16,17,19. Tandis que les gènes proneural peuvent induire la différenciation neuronale, leur expression oscillatoire n’est pas suffisante pour la différenciation neuronale ; leur expression soutenue est plutôt essentielle à la différenciation neuronale. L’expression oscillatoire des gènes proneural est importante pour maintenir des PNJ plutôt que pour induire la différenciation neuronale^14,15,16. L’expression de Dll1 oscille à la fois aux niveaux de transcription et de traduction au cours de diverses morphogenèses, telles que la neurogenèse et la somitogénèse. L’expression dynamique de Dll1 est importante pour la morphogénèse normale et l’expression régulière de Dll1 induit des défauts dans la neurogenèse et la somitogenèse¹⁷. Ces résultats démontrent la fonction importante que la dynamique de l’expression génique et de la cinétique protéique ont sur la régulation de divers événements développementaux (c.-à-d., différentes dynamiques d’expression produisent des sorties différentes dans les comportements cellulaires).

Pour analyser la dynamique de la signalisation Notch, l’analyse statique des tissus et des cellules est insuffisante parce qu’ils sont en constante évolution. L’imagerie en temps réel des cellules individuelles est un outil puissant pour révéler la dynamique de l’expression des gènes. L’expression dynamique des molécules de signalisation Notch subissent des réponses cycliques rapides dans la période de 2-3 h. Cette expression périodique rapide présente deux problèmes difficiles pour la surveillance en temps réel : (1) l’expression des molécules est supprimée à de faibles niveaux, et (2) le roulement rapide exige des journalistes de réponse rapide. Pour surmonter ces problèmes, nous avons déjà développé une méthode d’imagerie en temps réel de bioluminescence²⁰. Parce que le journaliste de bioluminescence a une sensibilité plus élevée et un temps de maturation plus court que les journalistes fluorescents, cette stratégie nous permet de surveiller la dynamique rapide dans les cellules vivantes. En utilisant la visualisation en temps réel, nous avons constaté que plus de gènes présentaient une expression dynamique que nous ne le pensions auparavant. En outre, le nombre de rapports montrant l’expression et la dynamique des protéines dans les cellules vivantes et l’importance de ces dynamiques dans divers événements biologiques a augmenté, suggérant un rôle fondamental de la dynamique dans les expressions génétiques^21,22.

Dans ce rapport, nous décrivons une manière de visualiser l’expression du Ligand de Notch Dll1 dans les PNJ dans les cultures dissociées et dans les cultures corticales de tranche. Pour surveiller la dynamique de la transcription de Dll1 aux niveaux de cellules simples, nous avons produit des cultures dissociées des PNJ dérivées du telencephalon embryonnaire des souris transgéniques portant le journaliste de pDll1-Ub-Fluc, un journaliste de luciferase déstabilisé d’Un promoteur Dll1. Pour surveiller la dynamique des protéines Dll1 in vivo, nous avons introduit le journaliste de fusion Dll1-Fluc dans les PNJ dans le cortex et visualisé l’expression du journaliste dans les PNJ dans les cultures de tranches corticales. L’imagerie en temps réel nous a permis de saisir les diverses caractéristiques de l’expression génique et de la dynamique des protéines dans les cellules vivantes à haute résolution temporelle.