Risonanza in tempo reale sulla bioluminescenza delle dinamiche di segnalazione di nota durante la neurogenesi di Murine

Il cervello dei mammiferi è composto da un gran numero di vari tipi di neuroni e cellule gliali. Tutte le cellule sono generate da cellule staminali neurali,progenitrici (NPC), che prima proliferano per espandere il loro numero, poi iniziano a differenziarsi in neuroni, e infine danno origine a cellule gliali^1,2,3,4,5. Una volta che le cellule si sono differenziate in neuroni, non possono proliferare o aumentare il loro numero e, quindi, il mantenimento dei PNG fino a quando le fasi successive non sono importanti. La segnalazione della notch tramite interazioni cella-cellula svolge un ruolo importante nel mantenimento dei PNG^6,7. I ligandi Notch interagiscono con la proteina della membrana, Notch, sulla superficie delle cellule vicine e attivano la proteina Notch. Dopo l’attivazione, si verifica la proteolisi della proteina Notch, rilasciando così il dominio intracellulare di Notch (NICD) dalla membrana cellulare nel nucleo^8,9,10. Nel nucleo, NICD si lega alle regioni promotrice di Hes1 e Hes5 (Hes1/5) e attiva l’espressione di questi geni. Hes1/5 reprime reprime reprimere l’espressione dei geni proneurali Ascl1 e Neurogenin1/2 (Neurog1/2)^11,12,13,14. Poiché i geni proneurali inducono la differenziazione neuronale, Hes1/5 svolge un ruolo essenziale nel mantenimento dei PNG. Inoltre, poiché i geni proneurali possono attivare l’espressione del Delta-come1 (Dll1), Hes1/5 reprimere anche l’espressione di Dll1. Pertanto, l’espressione di Dll1 porta alle celle adiacenti essere negativo per Dll1 tramite segnalazione Notch. In questo modo, le cellule impediscono alle cellule adiacenti di seguire il loro stesso destino, un fenomeno noto come inibizione laterale⁸. Nel cervello in via di sviluppo, l’inibizione laterale svolge un ruolo nella generazione di vari tipi di cellule diverse.

L’imaging in tempo reale a livello di singola cellula rivela le espressioni dinamiche dei componenti della segnalazione di Notch nei PNG^15,16,17. La segnalazione di notch attiva l’espressione di Hes1, ma la proteina Hes1 si lega al proprio promotore e reprime la propria espressione. Inoltre, Hes1 è una proteina estremamente instabile, che è degradata dal percorso onniquitina-proteasome; pertanto, la repressione del proprio promotore è solo di breve durata e poi la trascrizione ricomincia. In questo modo, l’espressione di Hes1 oscilla sia a livello di trascrizione che a livello traslazionale in un ciclo di 2 h¹⁸. L’espressione oscillatoria di Hes1, a sua volta, induce l’espressione oscillatoria dei geni bersaglio a valle, come Ascl1, Neurog2 e Dll1, attraverso la repressione periodica^15,16,17,19. Mentre i geni proneurali possono indurre la differenziazione neuronale, la loro espressione oscillatoria non è sufficiente per la differenziazione neuronale; piuttosto la loro espressione sostenuta è essenziale per la differenziazione neuronale. L’espressione oscillatoria dei geni proneurali è importante per mantenere i PNG piuttosto che per indurre la differenziazione neuronale^14,15,16. L’espressione di Dll1 oscilla sia a livello di trascrizione che a livello traslazionale durante varie morfogenesi, come la neurogenesi e la somitogenesi. L’espressione dinamica di Dll1 è importante per la normale morfogenesi e l’espressione costante di Dll1 induce difetti nella neurogenesi e somitogenesi¹⁷. Questi risultati dimostrano l’importante funzione che la dinamica dell’espressione genica e della cinetica proteica ha sulla regolazione di vari eventi dello sviluppo (cioè, dinamiche di espressione diverse producono risultati diversi nei comportamenti cellulari).

Per analizzare la dinamica della segnalazione di Notch, l’analisi statica dei tessuti e delle cellule è insufficiente perché cambia in continua evoluzione. L’imaging in tempo reale di singole cellule è un potente strumento per rivelare le dinamiche nell’espressione genica. L’espressione dinamica delle molecole di segnalazione Notch subisce risposte cicliche rapide nel periodo di 2-3 h. Questa rapida espressione periodica presenta due problemi difficili per il monitoraggio in tempo reale: (1) l’espressione delle molecole viene soppressa a bassi livelli e (2) un rapido turnover richiede una risposta rapida ai giornalisti. Per superare questi problemi, abbiamo precedentemente sviluppato un metodo di imaging in tempo reale di bioluminescenza²⁰. Poiché il reporter di bioluminescenza ha una sensibilità più elevata e tempi di maturazione più brevi rispetto ai reporter fluorescenti, questa strategia ci permette di monitorare le dinamiche rapide nelle cellule viventi. Utilizzando la visualizzazione in tempo reale, abbiamo scoperto che più geni mostravano un’espressione dinamica di quanto pensassimo in precedenza. Inoltre, è aumentato il numero di rapporti che mostrano l’espressione e la dinamica delle proteine nelle cellule viventi e il significato di queste dinamiche in vari eventi biologici, suggerendo un ruolo fondamentale delle dinamiche nelle espressioni geniche^21,22.

In questo rapporto viene descritto un modo per visualizzare l’espressione della Dll1 del ligando di Notch nei PNG sia nelle colture dissociate che nelle colture di taglio corticali. Per monitorare la dinamica della trascrizione Dll1 a livello di singola cellula, abbiamo generato colture dissociate di PNG derivate dal telencefano embrionale di topi transgenici che trasportano pDll1-Ub-Fluc reporter, un giornalista di luciferasi destabilizzate destabilizzato guidato dal promotore di Dll1. Per monitorare le dinamiche delle proteine Dll1 in vivo, abbiamo introdotto il reporter di fusione Dll1-Fluc nei PNG nella corteccia e abbiamo visualizzato l’espressione del reporter nei PNG nelle colture di fette corticali. L’imaging in tempo reale ci ha permesso di catturare le varie caratteristiche dell’espressione genica e della dinamica delle proteine nelle cellule viventi ad alta risoluzione temporale.