Биолюминесценция в режиме реального времени Визуализация динамики сигнализации во время Нейрогенеза Murine

Мозг млекопитающих состоит из большого количества различных типов нейронов и глиальных клеток. Все клетки генерируются из нервных стволовых / прародителей клеток (NPCs), которые сначала размножаются, чтобы расширить их число, затем начинают дифференцироваться в нейроны, и, наконец, привести к глиальных клеток^1,2,3,4,5. После того, как клетки дифференцированы в нейроны, они не могут размножаться или увеличивать их число, и, следовательно, поддержание NpCs до более поздних стадиях имеет важное значение. Прочка сигнализации через ячейки взаимодействия играет важную роль в поддержании NPCs^6,7. Выемка лиганды взаимодействуют с мембранным белком, Notch, на поверхности соседних клеток и активирует белок Notch. После активации происходит протеоз белка Notch, тем самым высвобождая внутриклеточное достояние Notch (NICD) из клеточной мембраны в ядро^8,9,10. В ядре NICD связывается с областями промотора Hes1 и Hes5 (Hes1/5) и активирует экспрессию этих генов. Hes1/5 подавляют экспрессию проневрюкгенных генов Ascl1 и Neurogenin1 (Neurog1/2)^11,12,13,14. Поскольку проневральные гены вызывают дифференциацию нейронов, Hes1/5 играет важную роль в поддержании NPC. Кроме того, поскольку проневрюновые гены могут активировать экспрессию Нотх лиганда Дельта-like1 (Dll1), Hes1/5 также подавляет экспрессию Dll1. Таким образом, выражение Dll1 приводит к тому, что соседние клетки являются отрицательными для Dll1 через Сигнализацию Notch. Таким образом, клетки ингибируют соседние клетки от следующих их же судьбы, явление, известное как боковое ингибирование⁸. В развивающемся мозге боковое ингибирование играет роль в генерации различных типов клеток.

Визуализация в режиме реального времени на уровне одной клетки показывает динамические выражения компонентов сигнализации Notch в^{NPC 15,16,17}. Прочка сигнализации активизирует выражение Hes1, но Hes1 белка связывается с собственным промоутером и подавляет свое собственное выражение. Кроме того, Hes1 является чрезвычайно нестабильным белком, который деградирует убиквитин-протеасомы пути; поэтому, репрессии своего собственного промоутера только недолго, а затем транскрипция начинается снова. Таким образом, выражение Hes1 колеблется как на транскрипции, так и на переводном уровне в цикле¹⁸2 ч. Колеблящее выражение Hes1, в свою очередь, индуцирует колебальное выражение нюшенных генов, таких как Ascl1, Neurog2, и Dll1, через периодические репрессии^15,16,17,19. В то время как проневральные гены могут вызвать дифференциацию нейронов, их колебательная экспрессия недостаточна для дифференциации нейронов; а их устойчивое выражение имеет важное значение для дифференциации нейронов. Колеблющее выражение проневральных генов важно для поддержания NPC, а не для индуцирования дифференциации нейронов^14,15,16. Выражение Dll1 колеблется как на транскрипции, так и на переводном уровне при различных морфогенезах, таких как нейрогенез и сомитогенез. Динамическое выражение Dll1 важно для нормального морфогенеза и устойчивое выражение Dll1 вызывает дефекты в нейрогенезе и сомитогенезе¹⁷. Эти выводы демонстрируют важную функцию, которую динамика экспрессии генов и кинетики белка оказывают на регуляцию различных событий развития (т.е. различная динамика экспрессии производит различные выходы в клеточном поведении).

Для анализа динамики сигнализации Notch статического анализа тканей и клеток недостаточно, так как они постоянно меняются. В режиме реального времени изображение одиночных клеток является мощным инструментом для выявления динамики экспрессии генов. Динамическое выражение сигнальных молекул Notch подвергается быстрым циклическим реакциям в период 2-3 ч. Это быстрое периодическое выражение представляет две трудные проблемы для мониторинга в реальном времени: (1) выражение молекул подавляется до низких уровней, и (2) быстрый оборот требует быстрого реагирования репортеров. Чтобы преодолеть эти проблемы, мы ранее разработали метод визуализации биолюминесценции в режиме реального времени²⁰. Поскольку биолюминесценция репортер имеет более высокую чувствительность и короче время созревания, чем флуоресцентные репортеры, эта стратегия позволяет нам контролировать быструю динамику в живых клетках. Используя визуализацию в реальном времени, мы обнаружили, что больше генов обладают динамическим экспрессией, чем мы думали ранее. Кроме того, увеличилось количество сообщений, показывающих экспрессию и белковую динамику в живых клетках и значение этой динамики в различных биологических событиях, что свидетельствует о фундаментальной роли динамики в экспрессиях генов^21,22.

В этом отчете мы описываем способ визуализации выражения Notch ligand Dll1 в NPC как в разобщенных культурах, так и в корковых срезанных культурах. Для мониторинга динамики транскрипции Dll1 на уровне одной клетки, мы создали разъединенные культуры NPCs, полученные из эмбрионального теленефалиона трансгенных мышей, несущих pDll1-Ub-Fluc репортер, Dll1 промоутер-управляемый дестабилизированной люциферазы репортер. Для мониторинга динамики белка Dll1 in vivo мы ввели репортера о слиянии Dll1-Fluc в NPC в коре головного мозга и визуализировали экспрессию репортера в NPC в корковых срезанных культурах. Изображения в режиме реального времени позволили нам запечатлеть различные особенности экспрессии генов и белковую динамику в живых клетках с высоким временным разрешением.