בזמן אמת ביולומינסנציה הדמיה של מערכת איתות דינמיקה במהלך מורנין נוירוגנזה
Summary
תאי גזע/מחולל קדמון מציגים דינמיקה של ביטויים שונים של רכיבי איתות מדרגה שמובילים לתוצאות שונות של אירועי הסלולר. ביטוי דינמי כזה יכול להתגלות על ידי ניטור בזמן אמת, לא על ידי ניתוח סטטי, באמצעות מערכת הדמיה ביולומינציה רגישה מאוד המאפשרת ויזואליזציה של שינויים מהירים בביטויי גנים.
Abstract
איתות מחריץ מווסת את התחזוקה של תאי גזע/מחולל שחור עצביים על-ידי אינטראקציות תא תא. הרכיבים של הביטוי הדינאמי של מוצג איתות. החריץ מדרגה Hes1 ו-Delta-like1 (Dll1) מבוטאים באופן מרוכך בתאי גזע/מחולל מעשה עצבי. מכיוון שתקופת הביטוי הנדנוד של הגנים הללו קצרה מאוד (2 שעות), קשה לעקוב אחר הביטוי המחזורי שלהם. כדי לבחון שינויים מהירים כאלה בביטוי הגנים או בדינמיקה החלבונים, נדרשים כתבים בתגובה מהירה. בגלל ההבשלה שלה מהירה קינטיקה ורגישות גבוהה, הכתב הביולומינסנציה לוציפראז מתאים לעקוב אחר שינויים ביטוי גנים מהיר בתאי החיים. השתמשנו בכתבת לוציפראז של יציבות לניטור פעילות היזם וכתבת התמזגו לוצין להדמיה של דינמיקת חלבון ברזולוציית תא בודדת. כתבים אלה הביולומינציה להראות מחזור מהיר וליצור אותות חלשים מאוד; לכן, פיתחנו מערכת הדמיה ביולומינציה רגישה מאוד כדי לזהות אותות קלושים כאלה. שיטות אלה מאפשרות לנו לנטר הדינמיקה של ביטוי גנים שונים בתאי החיים וברקמות, שהם מידע חשוב כדי לעזור להבין את המדינות הסלולריות בפועל.
Introduction
המוח המיונקים מורכב ממספר רב של סוגים שונים של נוירונים ותאי גליה. כל התאים נוצרים מתאי גזע/מחולל קדמון (npcs), אשר מתרבים הראשון כדי להרחיב את המספרים שלהם, ואז להתחיל להבדיל לנוירונים, ובסופו של דבר להצמיח תאים גליה1,2,3,4,5. לאחר תאים הבדיל לנוירונים, הם לא יכולים להתרבות או להגדיל את המספרים שלהם, ולכן, התחזוקה של NPCs עד שלבים מאוחרים יותר חשוב. איתות מדרגה דרך אינטראקציות תא תא ממלא תפקיד חשוב בשמירה על npcs6,7. החריץ מתקשר עם חלבון הממברנה, חריץ, על פני השטח של תאים שכנים ומפעיל את החלבון חריץ. לאחר ההפעלה, פרוטפוליזיס של חלבון חריץ מתרחשת, ובכך משחררים את התחום התאיים של חריץ (nicd) מן קרום התא לתוך הגרעין8,9,10. בגרעין, NICD נקשר לאזורי היזם של Hes1 ו Hes5 (Hes1/5) ומפעיל את הביטוי של גנים אלה. Hes1/5 לדכא את הביטוי של הגנים הפרניים Ascl1 ו Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. מכיוון גנים proneural לגרום לבידול עצבי, Hes1/5 לשחק תפקידים חיוניים בתחזוקת npcs. יתרה מזאת, כאשר גנים מפרניים יכולים להפעיל את הביטוי של החריץ ו-Delta-like1 (Dll1), Hes1/5 גם מדחיקים את ביטויו של Dll1. לכן, הביטוי של Dll1 מוביל לתאים שכנים שליליים עבור Dll1 באמצעות איתות מדרגה. בדרך זו, תאים מעכבים תאים סמוכים לאחר אותו גורל, תופעה המכונה עיכוב לרוחב8. במוח המתפתח, הדיכוי הרוחבי ממלא תפקיד ביצירת סוגי תאים שונים.
הדמיה בזמן אמת ברמת תא בודדת מגלה ביטויים דינאמיים של רכיבי איתות מדרגה ב-npcs15,16,17. איתות מחריץ מפעיל את הביטוי של Hes1, אך Hes1 חלבון נקשר ליזם משלו ומחדש את הביטוי שלו. יתר על כן, Hes1 הוא חלבון בלתי יציב מאוד, כי הוא מושפל על ידי אוביקוויב-פרוטאסאט מסלול; לכן, הדיכוי של היזם משלה הוא רק קצר החיים ולאחר מכן התמלול מתחיל שוב. בדרך זו, הביטוי של Hes1 נדנוד בשתי רמות שעתוק וטרנסלtional במחזור 2 h18. הביטוי הנדנוד של Hes1, בתורו, מעורר את הביטוי המסובב של הגנים של המטרה במורד הזרם, כגון Ascl1, Neurog2, וDll1, דרך הדחקה מחזורית15,16,17,19. בעוד הגנים הפראוניים יכולים לגרום לבידול עצבי, הביטוי הנדנוד שלהם אינו מספיק לבידול עצבי; בעצם הביטוי המתמשכת שלהם חיוני לבידול העצבי. הביטוי נדנוד של גנים proneural חשוב לשמירה על npcs במקום לגרימת בידול עצבי14,15,16. הביטוי של Dll1 מרוטים ברמות התמלול והטרנסלאיזם במהלך שונות, כגון נוירוגנזה וסוטוגנזה. הביטוי הדינמי של Dll1 חשוב עבור מורגנזה נורמלי ביטוי קבוע של Dll1 גורם פגמים נוירוגנזה ו somitogenesis17. ממצאים אלה מדגימים את הפונקציה החשובה כי הדינמיקה של ביטוי גנים וקינטיקה חלבונים יש על הרגולציה של אירועים התפתחותיים שונים (כלומר, דינמיקה ביטוי שונה לייצר תפוקות שונות התנהגויות סלולר).
כדי לנתח את הדינמיקה של איתות מדרגה, הניתוח הסטטי של רקמות ותאים אינו מספיק מכיוון שהם משתנים ללא הרף. בזמן אמת הדמיה של תאים בודדים הוא כלי רב עוצמה כדי לחשוף את הדינמיקה ביטוי גנים. הביטוי הדינמי של מולקולות איתות מהירות עוברות תגובות מחזורית בתקופה של 2-3 h. ביטוי תקופתי מהיר זה מציג שתי בעיות קשות לניטור בזמן אמת: (1) הביטוי של המולקולות מדוכא רמות נמוכות, ו (2) מחזור מהיר דורש כתבים בתגובה מהירה. כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו בעבר ביולומינציה בזמן אמת שיטה הדמיה20. מכיוון שלעיתונאי הביולומינסנציה יש רגישות גבוהה יותר וזמן התבגרות קצר יותר מאשר כתבים פלורסצנט, אסטרטגיה זו מאפשרת לנו לעקוב אחר הדינמיקה המהירה בתאי החיים. שימוש בהדמיה בזמן אמת, גילינו כי גנים נוספים הציגו ביטוי דינמי משחשבנו בעבר. בנוסף, מספר הדיווחים המציגים ביטוי ודינמיקה חלבונים בתאי החיים והמשמעות של הדינמיקה הללו באירועים ביולוגיים שונים גדל, מציע תפקיד בסיסי של הדינמיקה ביטויים גנים21,22.
בדוח זה, אנו מתארים דרך להמחיש את הביטוי של החריץ והDll1 ב NPCs בתרבויות המונתק ובתרבויות הפרוסה הקורטיקלית. כדי לנטר את הדינמיקה של תמלול Dll1 ברמות תא בודד, יצרנו תרבויות מופקות של npcs שנגזר מהטלנצאלון העובריים של עכברים טרנסגניים הנושאים את הכתבת PDll1-רוב-fluc, הכתבת לוציפראאז מונחה-מיזם Dll1. כדי לפקח על הדינמיקה Dll1 חלבון ב vivo, הצגנו את הכתב היתוך Dll1-Fluc לתוך NPCs בקליפת המוח ודמיינו את הביטוי של הכתב NPCs בתרבויות פרוסת הקליפה. הדמיה בזמן אמת אפשרה לנו ללכוד את התכונות השונות של ביטוי גנים ודינמיקה חלבונים בתאי החיים ברזולוציה הטמפורלית הגבוהה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מרכיבי האיתות החריץ מציגים ביטויים מרוטים ב-סנכרון במהלך התקופה האחרונה, אלא מתוך סנכרון במהלך נוירוגנזה, המובילה לקשיים בלכידת דינמיקת הביטוי באמצעות ניתוח סטטי במקרה האחרון. לפיכך, ניטור זמן אמת נדרש כדי לחשוף את דינמיקת הביטוי של רכיבי איתות מדרגה, כגון Hes1 ו- Dll1. מכיוון שתקופו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ליומיקו איוומוטו על התמיכה בייצור וידאו. אנו גם אסירי תודה לאקיהירו איזוטורה לדיון ולתמיכה בניתוח תמונה, היטושי מייניה לתמיכה טכנית עבור דור של בעלי חיים טרנסגניים, Yuji Shinjo (האולימפוס מדע הרפואה), Masatoshi אגאווה (האולימפוס מדע הרפואה), Takuya אישיזו ( האולימפוס מדע הרפואה) ו Ouin Kunitaki (Andor יפן) עבור תמיכה טכנית ודיונים של מערכת הדמיה biלומינסנציה. עבודה זו נתמכת על-ידי מחקר הליבה של המדע האבולוציונית והטכנולוגיה (JPMJCR12W2) (ק), גרנט-עזרה עבור מחקר מדעי על אזורים חדשניים (MEXT 24116705 עבור H.S. ו MEXT 16H06480 עבור ק), גרנט ב-עזרה עבור מחקר מדעי (C) (JSPS 18K06254) (H.S.), קרן טקדה (ק וH.S.), ופלטפורמה לגישות דינמיות למערכת החיים ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה, יפן.
Materials
| Bioluminescence Imaging System | |||
| Chilled water circulator (chiller) | Julabo | Model: F12-ED | |
| Cooled CCD camera | Andor Technology | Model: iKon-M 934 | |
| Incubator system | TOKAI HIT | Model: INU-ONICS | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX81 | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX83 | |
| LED illumination device | CoolLED | Model: pE1 | |
| MetaMorph | MOLECULAR DEVICES | Model: 40000 | |
| Mix gas controller | Tokken | Model: TK-MIGM OLO2 | |
| Objective lens | Olympus | Model: UPLFLN 40X O | |
| Preparations for Dissection | |||
| Dissection microscope | Nikon | Model: SMZ-2B | |
| Fluorescence stereoscopic microscope | Leica | Model: MZ16FA | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Scissors, Micro scissors | |||
| Forceps | |||
| Ring-shaped forceps | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Reagents for NPC dissociation culture | |||
| B27 supplement | invitrogen | 12587-010 | |
| bFGF | invitrogen | 13256-029 | Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS |
| D-luciferin | Nacalai Tesque | 01493-85 | Stock solution: 100mM in 0.9% saline |
| DNase | Worthington Biochemical Corporation | LK003172 | Stock solution: 1000U/ml in EBSS |
| EBSS | Worthington Biochemical Corporation | LK003188 | |
| Glass bottom dish | IWAKI | 3910-035 | |
| N2 supplement (100x) | invitrogen | 17502-048 | |
| N-acetyl-cystein | Sigma | A-9165-25G | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LK003178 | Stock solution: 7U/ml in EBSS |
| Penicillin/Streptmycine | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P-6281 | 40 mg/ml in DW |
| Preparations for in utero electroporation | |||
| 50-ml syringe | TERUMO | 181228T | |
| Electrode | Neppagene | 7-mm | |
| Electroporator | Neppagene | CUY21 EDIT | |
| Forceps | |||
| Gauzes | Kawamoto co. | 7161 | |
| Micro capillary | Made in-house | ||
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Pentbarbital | Kyoritsuseiyaku | Somnopentyl | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Suture needle | Akiyama MEDICAL MFG. CO | F17-40B2 | |
| Xylazine | Bayer | Seractal | |
| Preparations for Slice culture | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| Culture insert | Millipore | PICM01250 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012-500ML | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Forceps | |||
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Micro surgical knife | Alcon | 19 Gauge V-Lance | |
| Multi-gas incubator | Panasonic | MCO-5MUV-PJ | |
| N2/B27 media | Made in-house | ref. NPC dissociatioin culture | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Silicon rubber cutting board | Made in-house |
References
- Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
- Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Paridaen, J. T., Huttner, W. B. Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system. EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. Notch signaling in vertebrate neural development. Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).
- Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks. Neuron. 69, 840-855 (2011).
- Bray, S. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
- Bray, S. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).
- Kopan, R., Ilagan, M. X. G. The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism. Cell. 137, 216-233 (2009).
- Ishibashi, M., et al. Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system. The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).
- Ohtsuka, T., et al. Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation. The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).
- Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain. Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).
- Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis. Development. 134, 1243-1251 (2007).
- Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors. Neuron. 58, 52-64 (2008).
- Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Shimojo, H., et al. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes and Development. 30, 102-116 (2016).
- Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
- Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition. Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).
- Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).
- Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342, 1193-1200 (2013).
- Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152, 945-956 (2013).
- Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice. Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).
- Yamaguchi, S., et al. Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
- Kiyohara, Y. B., et al. The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).
- Behar, M., Hoffmann, A. Understanding the temporal codes of intra-cellular signals. Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic Gene Expression in a Single Cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
- Nelson, D. E., et al. Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression. Science. 306, 704-708 (2004).
- Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
- Hansen, A. S., O’Shea, E. K. Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression. Molecular Systems Biology. 9, 704 (2014).
- Hansen, A. S., O’Shea, E. K. cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale. Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).
- Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo. Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).
- Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: Progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
- Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay. Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).
- Nakajima, Y., et al. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, (2010).
- Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12, (2013).
