Real-time bioluminescentie beeldvorming van Inkeping signalering dynamiek tijdens Murine neurogenese

Het zoogdier brein bestaat uit een groot aantal verschillende soorten neuronen en gliacellen. Alle cellen worden gegenereerd uit neurale stam/voorlopercellen (npc’s), die eerst prolifereren om hun getallen uit te breiden, dan beginnen te differentiëren in neuronen, en ten slotte geven aanleiding tot gliacellen^1,2,3,4,5. Zodra cellen zijn gedifferentieerd in neuronen, ze kunnen niet vermenigvuldigen of hun aantallen te verhogen, en daarom, het onderhoud van Npc’s tot latere stadia is belangrijk. Notch signalering via celcelinteracties speelt een belangrijke rol bij het handhaven van npc’s^6,7. Notch liganden interactie met het membraan eiwit, Inkeping, op het oppervlak van de naburige cellen en activeert de inkeping eiwit. Na activering komt proteolyse van Inkeping eiwit voor, waardoor het intracellulaire domein van Inkeping (NiCd) van het celmembraan in de Nucleus^8,9,10wordt vrijgegeven. In de Nucleus bindt NICD aan de organisator regio’s van Hes1 en Hes5 (Hes1/5) en activeert de expressie van deze genen. Hes1/5 Druk op de uitdrukking van de proneural genen Ascl1 en Neurogenin1/2 (Neurog1/2)^11,12,13,14. Omdat proneural genen neuronale differentiatie induceren, spelen Hes1/5 essentiële rollen bij het onderhouden van npc’s. Bovendien, als proneural genen de uitdrukking van de inkeping ligand Delta-like1 (Dll1-) kunnen activeren, Hes1/5 ook onderdrukken de uitdrukking van dll1-. Daarom, de uitdrukking van Dll1-leidt tot de naburige cellen negatief voor Dll1-via inkeping signalering. Op deze manier, cellen remmen aangrenzende cellen van het volgen van hun zelfde lot, een fenomeen bekend als de laterale remming⁸. In de ontwikkelende hersenen speelt laterale remming een rol bij het genereren van verschillende celtypen.

Real-time beeldvorming op het niveau van één cel onthult dynamische expressies van de componenten van Inkeping signalering in npc’s^15,16,17. Notch signalering activeert de uitdrukking van Hes1, maar Hes1 eiwit bindt aan zijn eigen promotor en onderdrukt zijn eigen uitdrukking. Bovendien is Hes1 een extreem onstabiel eiwit, dat wordt aangetast door het ubiquitin-proteasome traject; Daarom is de onderdrukking van zijn eigen promotor slechts van korte duur en vervolgens begint de transcriptie opnieuw. Op deze manier, de uitdrukking van Hes1 schommelt op zowel de transcriptie en translationele niveaus in een 2 h cyclus¹⁸. De oscillerende uitdrukking van Hes1 induceert op zijn beurt de oscillerende expressie van de downstream-doel genen, zoals Ascl1, Neurog2 en dll1-, via periodieke repressie^15,16,17,19. Terwijl proneural genen neuronale differentiatie kunnen induceren, is hun oscillerende expressie niet voldoende voor Neuronale Differentiatie; hun aanhoudende expressie is veeleer essentieel voor de neuronale differentiatie. De oscillerende expressie van proneural genen is belangrijk voor het onderhouden van npc’s in plaats van voor het induceren van neuronale differentiatie^14,15,16. De uitdrukking van dll1- oscilleert op zowel de transcriptie-als translationele niveaus tijdens verschillende morfogenese, zoals neurogenese en somitogenese. De dynamische expressie van dll1- is belangrijk voor de normale morfogenese en gestage expressie van dll1-induceert defecten in neurogenese en somitogenese¹⁷. Deze bevindingen tonen de belangrijke functie die de dynamiek van genexpressie en eiwit kinetiek heeft op de regulering van verschillende ontwikkelings gebeurtenissen (d.w.z. dat verschillende expressie dynamiek verschillende outputs in cellulair gedrag oplevert).

Voor het analyseren van de dynamiek van Inkeping signalering, de statische analyse van weefsels en cellen zijn onvoldoende omdat ze voortdurend veranderen. Real-time beeldvorming van enkele cellen is een krachtig hulpmiddel om de dynamiek in genexpressie te onthullen. De dynamische uitdrukking van inkepingen signalering moleculen ondergaan snelle cyclische reacties in de periode van 2-3 h. Deze snelle periodieke uitdrukking presenteert twee moeilijke problemen voor de real-time monitoring: (1) de uitdrukking van de moleculen wordt onderdrukt tot lage niveaus, en (2) snelle omzet vereist snelle respons Reporters. Om deze problemen te overwinnen, ontwikkelden we eerder een bioluminescentie real-time beeldvormings methode²⁰. Omdat de Bioluminescentie reporter een hogere gevoeligheid en kortere rijpingstijd heeft dan fluorescerende reporters, stelt deze strategie ons in staat om de snelle dynamiek in levende cellen te monitoren. Met behulp van real-time visualisatie ontdekten we dat meer genen dynamische expressie vertoonden dan we eerder dachten. Daarnaast is het aantal rapporten met uitdrukking en eiwit dynamiek in levende cellen en de betekenis van deze dynamiek in verschillende biologische gebeurtenissen toegenomen, wat een fundamentele rol van de dynamiek in genexpressies^21,22suggereert.

In dit rapport beschrijven we een manier om de uitdrukking van de inkeping ligand dll1-in npc’s in zowel gezien culturen als in corticale segment culturen te visualiseren. Om de dynamiek van dll1- transcriptie op één celniveau te monitoren, genereerden we gezien culturen van npc’s afgeleid van de embryonale telencephalon van transgene muizen met pDll1-UB-Fluc Reporter, een dll1-Promoter-gedreven gedestabiliseerde plaats Reporter. Om Dll1-proteïne dynamica in vivo te monitoren, introduceerden we de Dll1–Fluc Fusion reporter in Npc’s in de cortex en visualiseerde de uitdrukking van de reporter in Npc’s in corticale segment culturen. Real-time Imaging stelde ons in staat om de verschillende kenmerken van genexpressie en eiwit dynamiek in levende cellen te vangen met een hoge temporele resolutie.