Imágenes de bioluminiscencia en tiempo real de la dinámica de señalización de muesca durante la neurogénesis de la murino

El cerebro de los mamíferos se compone de un gran número de varios tipos de neuronas y células gliales. Todas las células se generan a partir de células neurales madre/progenitoras (NNP), que primero proliferan para expandir sus números, luego comienzan a diferenciarse en neuronas, y finalmente dan lugar a células gliales^1,2,3,4,5. Una vez que las células se han diferenciado en neuronas, no pueden proliferar o aumentar su número, y, por lo tanto, el mantenimiento de los PNJ hasta etapas posteriores es importante. La señalización de muesca a través de interacciones célula-célula desempeña un papel importante en el mantenimiento de los PNJ^6,7. Los ligandos de muesca interactúan con la proteína de membrana, Notch, en la superficie de las células vecinas y activa la proteína Notch. Después de la activación, se produce proteólisis de la proteína Notch, liberando así el dominio intracelular de Notch (NICD) de la membrana celular en el núcleo^8,9,10. En el núcleo, NICD se une a las regiones promotoras de Hes1 y Hes5 (Hes1/5) y activa la expresión de estos genes. Hes1/5 reprime la expresión de los genes proneurales Ascl1 y Neurogenin1/2 (Neurog1/2)^11,12,13,14. Debido a que los genes proneurales inducen la diferenciación neuronal, Hes1/5 desempeña un papel esencial en el mantenimiento de los PNJ. Además, como los genes proneurales pueden activar la expresión del ligando Delatal como 1 (Dll1), Hes1/5 también reprime la expresión de Dll1. Por lo tanto, la expresión de Dll1 conduce a que las celdas vecinas sean negativas para Dll1 a través de la señalización Notch. De esta manera, las células inhiben que las células adyacentes sigan su mismo destino, un fenómeno conocido como inhibición lateral^8. En el cerebro en desarrollo, la inhibición lateral juega un papel en la generación de varios tipos de células diferentes.

La imagen en tiempo real a nivel de celda única revela expresiones dinámicas de los componentes de la señalización Notch en NPC^15,16,17. La señalización de muesca activa la expresión de Hes1,pero la proteína Hes1 se une a su propio promotor y reprime su propia expresión. Además, Hes1 es una proteína extremadamente inestable, que se degrada por la vía ubiquitina-proteasoma; por lo tanto, la represión de su propio promotor es sólo de corta duración y luego la transcripción comienza de nuevo. De esta manera, la expresión de Hes1 oscila tanto a nivel de transcripción como traslacional en un ciclo de 2 h^18. La expresión oscilatoria de Hes1, a su vez, induce la expresión oscilatoria de los genes diana aguas abajo, como Ascl1, Neurog2 y Dll1, a través de la represión periódica^15,16,17,19. Mientras que los genes proneurales pueden inducir la diferenciación neuronal, su expresión oscilatoria no es suficiente para la diferenciación neuronal; más bien su expresión sostenida es esencial para la diferenciación neuronal. La expresión oscilatoria de genes proneurales es importante para mantener los PNJ en lugar de inducir la diferenciación neuronal^14,15,16. La expresión de Dll1 oscila tanto a nivel de transcripción como traslacional durante diversas morfogénesis, como la neurogénesis y la somitogénesis. La expresión dinámica de Dll1 es importante para la morfogénesis normal y la expresión constante de Dll1 induce defectos en la neurogénesis y la somitogénesis^17. Estos hallazgos demuestran la importante función que la dinámica de la expresión génica y la cinética proteica tienen en la regulación de diversos eventos de desarrollo (es decir, diferentes dinámicas de expresión producen diferentes resultados en los comportamientos celulares).

Para analizar la dinámica de la señalización de la muesca, el análisis estático de los tejidos y las células es insuficiente porque están cambiando constantemente. La toma de imágenes en tiempo real de células individuales es una poderosa herramienta para revelar la dinámica en la expresión génica. La expresión dinámica de las moléculas de señalización de Notch sufre respuestas cíclicas rápidas en el período de 2-3 h. Esta rápida expresión periódica presenta dos problemas difíciles para el monitoreo en tiempo real: (1) la expresión de las moléculas se suprime a niveles bajos, y (2) la rotación rápida requiere reporteros de respuesta rápida. Para superar estos problemas, previamente desarrollamos un método de imagen en tiempo real de bioluminiscencia²⁰. Debido a que el reportero de bioluminiscencia tiene una mayor sensibilidad y un tiempo de maduración más corto que los reporteros fluorescentes, esta estrategia nos permite monitorear la dinámica rápida en las células vivas. Usando la visualización en tiempo real, encontramos que más genes mostraban una expresión dinámica de lo que habíamos pensado anteriormente. Además, ha aumentado el número de informes que muestran la expresión y la dinámica de proteínas en las células vivas y la importancia de estas dinámicas en diversos eventos biológicos, lo que sugiere un papel fundamental de la dinámica en las expresiones génicas^21,22.

En este informe, se describe una manera de visualizar la expresión del ligando de la muesca Dll1 en los NNJ tanto en cultivos disociados como en cultivos de sectores corticales. Para monitorear la dinámica de la transcripción de Dll1 a niveles de una sola célula, generamos cultivos disociados de PNJ derivados del telencéfalo embrionario de ratones transgénicos que transportaban a un reportero pDll1-Ub-Fluc, un reportero de luciferasa desestabilizado impulsado por el promotor de Dll1. Para monitorear la dinámica de proteínas Dll1 in vivo, introdujimos el reportero de fusión Dll1-Fluc en los PNJ en la corteza y visualizamos la expresión del reportero en los PNJ en cultivos de rebanadas corticales. Las imágenes en tiempo real nos permitieron capturar las diversas características de la expresión génica y la dinámica de proteínas en células vivas a alta resolución temporal.