Imagens de bioluminescência em tempo real da dinâmica de sinalização de notch durante a neurogênese de Murine

O cérebro de mamíferoé composto por um grande número de vários tipos de neurônios e células gliais. Todas as células são geradas a partir de células de tronco neural /progenitoras (NPCs), que primeiro proliferam para expandir seus números, em seguida, começam a se diferenciar em neurônios e, finalmente, dar origem às células gliais^1,2,3,4^,5. Uma vez que as células se diferenciaram em neurônios, elas não podem proliferar ou aumentar seus números e, portanto, a manutenção de NPCs até estágios posteriores é importante. Notch sinalização através de interações célula-célula desempenha um papel importante na manutenção npcs^6,7. Os ligantes de notch interagem com a proteína da membrana, Notch, na superfície das células vizinhas e ativa mproteína Notch. Após a ativação, ocorre a proteólese da proteína Notch, liberando assim o domínio intracelular de Notch (NICD) da membrana celular para o núcleo^8,9,10. No núcleo, nicd liga-se às regiões promotorde Hes1 e Hes5 (Hes1/5)e ativa a expressão desses genes. Hes1/5 reprimir a expressão dos genes proneuris Ascl1 e Neurogenin1/2 (Neurog1/2)^11,12,13,14. Como os genes neurais induzem a diferenciação neuronal, Hes1/5 desempenha papéis essenciais na manutenção de NPCs. Além disso, como os genes proneuris podem ativar a expressão do Entalhe ligand Delta-like1 (Dll1), Hes1/5 também reprimir a expressão de Dll1. Portanto, a expressão de Dll1 leva a células vizinhas sendo negativa para Dll1 via sinalização Notch. Desta forma, as células inibem as células adjacentes de seguir seu mesmo destino, um fenômeno conhecido como a inibição lateral⁸. No cérebro em desenvolvimento, a inibição lateral desempenha um papel na geração de vários tipos de células diferentes.

Imagens em tempo real no nível único celular revela expressões dinâmicas dos componentes da sinalização Notch em NPCs^15,16,17. Notch sinalização ativa a expressão de Hes1, mas a proteína Hes1 se liga ao seu próprio promotor e reprime sua própria expressão. Além disso, Hes1 é uma proteína extremamente instável, que é degradada pela via ubiquitina-proteasome; Portanto, a repressão de seu próprio promotor é de curta duração e, em seguida, a transcrição começa novamente. Desta forma, a expressão de Hes1 oscila tanto nos níveis de transcrição quanto translacional em um ciclo¹⁸de 2 h. A expressão oscilatória de Hes1, por sua vez, induz a expressão oscilatória dos genes-alvo a jusante, como Ascl1, Neurog2 e Dll1, via repressão periódica^{15,16,17, 19}. Enquanto os genes neurais podem induzir diferenciação neuronal, sua expressão oscilatória não é suficiente para diferenciação neuronal; sim sua expressão sustentada é essencial para a diferenciação neuronal. A expressão oscilatória de genes proneuris é importante para a manutenção de NPCs em vez de induzir diferenciação neuronal^14,15,16. A expressão de Dll1 oscila em ambos os níveis de transcrição e translação durante várias morfogêneses, como neurogênese e somitogênese. A expressão dinâmica do Dll1 é importante para a morgênese normal e expressão constante de Dll1 induz defeitos na neurogênese e somitogênese¹⁷. Estes resultados demonstram a função importante que a dinâmica da expressão do gene e da cinética da proteína tem no regulamento de vários eventos desenvolventes (isto é, dinâmica diferente da expressão produz saídas diferentes em comportamentos celulares).

Para analisar a dinâmica da sinalização notch, a análise estática de tecidos e células são insuficientes porque eles estão em constante mudança. Imagens em tempo real de células únicas é uma ferramenta poderosa para revelar a dinâmica na expressão gênica. A expressão dinâmica das moléculas de sinalização notch sofre respostas cíclicas rápidas no período de 2-3 h. Esta rápida expressão periódica apresenta dois problemas difíceis para o monitoramento em tempo real: (1) a expressão das moléculas é suprimida a níveis baixos, e (2) a rotatividade rápida requer repórteres de resposta rápida. Para superar esses problemas, anteriormente desenvolvemos um método de imagem em tempo real de bioluminescência^20. Como o repórter de bioluminescência tem maior sensibilidade e menor tempo de maturação do que os repórteres fluorescentes, essa estratégia nos permite monitorar a dinâmica rápida nas células vivas. Usando a visualização em tempo real, descobrimos que mais genes exibiam expressão dinâmica do que pensávamos anteriormente. Além disso, o número de relatos que mostram expressão e dinâmica proteica em células vivas e o significado dessas dinâmicas em vários eventos biológicos tem aumentado, sugerindo um papel fundamental da dinâmica nas expressões gênicas^21,22.

Neste relatório, descrevemos uma maneira de visualizar a expressão do Notch ligand Dll1 em NPCs em culturas dissociadas e em culturas de fatias corticais. Para monitorar a dinâmica da transcrição Dll1 em níveis de célulaúnica, geramos culturas dissociadas de NPCs derivadas da telencefalon embrionária de camundongos transgênicos carregando repórter pDll1-Ub-Fluc, um repórter lúciferase desestabilizado dirigido por promotor dll1. Para monitorar a dinâmica da proteína Dll1 in vivo, introduzimos o repórter de fusão Dll1-Fluc em NPCs no córtex e visualizamos a expressão do repórter em NPCs em culturas de fatias corticais. Imagens em tempo real nos permitiram capturar as várias características da expressão gênica e da dinâmica proteica em células vivas em alta resolução temporal.