Una spettroscopia Raman integrata e una piattaforma di spettrometria di massa per studiare l'assorbimento di farmaci a singola cellula, il metabolismo e gli effetti

1. Cultura cellulare cellule di coltura di interesse in un supporto di coltura appropriato. La penicillina-streptomicina può essere aggiunta per evitare la contaminazione. Nel caso delle cellule HepG2, le cellule di coltura in un supporto di coltura contenente il mezzo di Aquila modificato di Dulbecco (DMEM) sono state integrate con 10% siero bovino fetale (FBS) e 0,1% penicillina-streptomicina. Per facilare le misurazioni della spettroscopia Raman, le cellule possono essere coltivate su un piatto in vetro rivestito di gelatina dello 0,1% o vetrini al quarzo. Incubare le cellule per 2 giorni a 37 e 5% DI CO2 in un’incubatrice umidificata. Sincronizza le colture cellulari per raggiungere la confluenza del 70%. Le cellule di sottocoltura in una piastra di griglia inferiore in vetro da 35 mm o vetrini al quarzo utilizzando lo stesso mezzo ad una densità di semina di 0,7 x 106, quindi incubano a 37 gradi centigradi per 24 h.NOTA: I piatti di coltura o i vetrini possono essere pre-rivestiti con una soluzione di rivestimento di collagene o gelatina con un rapporto di superficie di coltura di 5 ug/cm2 per consentire loro di fissare, garantendo la loro sopravvivenza durante la misurazione. 2. Trattamento della droga Rimuovere le colture cellulari dall’incubatrice e lavare 2x con tampone PBS preriscaldato (37 gradi centigradi).NOTA: È ottimale rimuovere le cellule per il trattamento farmacologico a una confluenza del 50%-60%. Dividere le cellule in sottogruppi trattati con farmaci e non trattati in piatti di coltura 35 mm. Mescolare la droga di scelta con i media di coltura. Ad esempio, sciogliere il tamoxifene nel solforosi dimetilo (DMSO) e mescolare con i mezzi di coltura per ottenere un volume finale di 2 mL e tamoxifene di 10 mL. Questo sarà il gruppo trattato con la droga. Mescolare un volume corrispondente di solvente (DMSO) nel mezzo come controllo per studiare gli effetti del DMSO. Questo sarà il gruppo di controllo. Incubare entrambi i gruppi in 2 mL del supporto a spillo preparato nei passi 2.3-2.4 per 24 h. La confluenza prevista dopo l’incubazione dovrebbe essere del 70%-80%. 3. Imaging spettrale Raman ed elaborazione spettrale NOTA: Sebbene i sistemi di spettroscopia Raman siano disponibili in commercio, il sistema di spettroscopia Raman utilizzato qui è un microscopio confocale a scansione lineare costruito in casa descritto in precedenza7,8. In breve, questo sistema è dotato di un laser a stato solido pompato da 532 nm. La luce laser viene modellata in un piano utilizzando una lente cilindrica, che consente la misurazione di 400 spettri in un’unica esposizione. Gli spettri Raman sono stati registrati utilizzando una telecamera CCD raffreddata montata su un policromatore che utilizza una griglia 1.200 scanalature/mm per massimizzare la risoluzione spettrale della regione delle impronte digitali (da 500-1.800 cm-1). Questa area spettrale contiene un’alta densità di frequenze specifiche per le molecole che genera la dispersione Raman. Viene utilizzata anche una lente per l’acqua-immersione (NA – 0,95). La risoluzione spaziale di questo sistema è di 300 nm e la risoluzione spettrale è 1 cm-1. Per garantire la sopravvivenza delle cellule durante l’esperimento, viene utilizzata una microcamera fissata su uno stadio motorizzato al microscopio. Prima delle misurazioni spettrali, verificare l’allineamento dell’ottica. Per verificare che il foro stenopeico e la posizione laser corrispondano esattamente. Inserire lo spettrofotometro fessura quando si restringe il più possibile. Utilizzare l’etanolo per calibrare lo spettrofotometro prima di ogni esperimento. Per farlo, posiziona EtOH in un piatto con fondo di vetro, misura lo spettro a una data intensità laser (misurata al campione) per 1 s e associa il picco alle lunghezze d’onda note7. Ridurre l’intensità del laser al campione a 2,4 mW/m2 in modo che le cellule sopravvivano all’esposizione al laser. Impostare la microcamera al 5% di CO2 e 37 gradi centigradi. Una volta che il sistema di microscopio è pronto, rimuovere le cellule dall’incubatrice e risciacquare immediatamente le cellule 2x con tampone PBS (37 gradi centigradi) riscaldato, quindi aggiungere 2 mL di PBS riscaldato (37 o C) o DMEM per risospendere le cellule.NOTE: Sia i supporti basati su PBS che FluoroBrite DMEM sono opzioni sufficienti per le misurazioni della spettroscopia Raman perché producono un segnale di fondo minimo. Aggiungere 10 l’acqua sulla lente dell’obiettivo di immersione dell’acqua e posizionare delicatamente la teglia a cellule del fondo di vetro sullo stadio del microscopio. Misurare ogni cella concentrando la linea laser. Un tempo di esposizione di 15 s per cella è sufficiente qui per ottenere una sezione trasversale di una cella con un segnale Raman chiaro. Uno specchio galvano consente la scansione di una cella o di un gruppo di celle in diverse decine di minuti.NOTE: Una maggiore risoluzione dell’imaging spettrale completo delle cellule richiede più tempo e può causare fotodanni. Qui, le cellule sono state misurate utilizzando un’esposizione a riga singola per ottenere una sezione trasversale di ogni cellula. Questo approccio è un buon compromesso per aumentare la produttività e ottenere informazioni sufficienti per discriminare le cellule, garantendo al contempo la vitalità delle cellule limitando i danni fotografici. 4. Pre-elaborazione di dati spettrali e analisi multivariate NOTA: la pre-elaborazione è un passaggio necessario prima dell’analisi aggiuntiva per rimuovere le variazioni tecniche indesiderate all’interno dei dati spettrali. A causa della diversità dei metodi e del software, non è possibile fornire un elenco esaustivo e ci sono molte recensioni utili trovate nella letteratura7,8. In questa sezione viene brevemente descritto l’approccio utilizzato per analizzare e interpretare i dati spettrali Raman ottenuti da singole cellule viventi. Estrarre e pre-elaborare le immagini Raman per rimuovere possibili interferenze cosmiche dei raggi.NOTA: L’asse spettrale degli spettri ottenuti durante diversi giorni/settimane/mesi può includere alcune variazioni dovute a piccole variazioni tecniche durante la calibrazione utilizzando l’etanolo. Ciò avrà un forte impatto sulle successive analisi multivariate e sui confronti statistici. Nel caso in cui gli esperimenti vengano eseguiti durante settimane/mesi diversi, si prevedono piccole variazioni ottiche. In questo caso, i dati devono essere interpolati per correggere eventuali spostamenti spettrali dei dati tra gli esperimenti. Qui viene utilizzata l’interpolazione con spline cubica. Dopo questo passaggio, tutti gli assi degli spettri devono essere allineati. Un intervallo di 500-1.800 cm-1 è considerato per l’analisi successiva. Estrarre i dati spettrali delle celle e dello sfondo (assenza di celle) da ogni immagine utilizzando un algoritmo fatto in casa. Sottrarre il segnale di sfondo dal segnale della cella. Quindi, calcolare la media degli spettri dei pixel rimanenti, che devono corrispondere a una singola cella. I passaggi seguenti vengono eseguiti utilizzando gli spettri 2D delle celle. Eseguire una correzione della linea di base utilizzando il ModPoly9 o qualsiasi altro algoritmo che ha stimato di adattarsi sufficientemente. Tagliare la gamma spettrale a 600-1.700 cm-1 per selezionare la regione di impronte digitali e assicurarsi che non vi siano effetti indesiderati del bordo sugli spettri a causa di un cattivo raccordo polinomiale. Eseguire un passaggio di normalizzazione come la normalizzazione vettoriale (l’intensità a ogni numero d’onda è divisa per la norma l2 globale o il valore massimo singolare di uno spettro) per normalizzare l’intensità spettrale10, anche se altre normalizzazioni possono essere considerate. Preparare un set di dati con l’etichetta appropriata per ogni classe/condizione.NOTA: È possibile analizzare comparativamente le analisi spettrali per esplorare la natura delle possibili differenze tra la classe/condizioni della cellula (ad esempio, sottraendo lo spettro medio del gruppo di controllo ad altri gruppi per identificare le regioni di interesse [come i potenziali biomarcatori]). I calcoli dei punteggi ANOVA e Fisher possono anche essere eseguiti10. Per identificare le cellule trattate e non trattate in base alle caratteristiche spettrali, è possibile applicare analisi multivariate. I dati spettrali normalizzati devono essere usati come set di dati di training e un set di dati sconosciuto (senza etichetta) di un esperimento di replica deve essere usato come dati di test, se possibile.NOTA: l’analisi discriminante eseguita su un vettore di un’analisi dei componenti principali (PCA-DA10),la proiezione sui punteggi latenti seguita dall’analisi discriminante (PLS-DA) e le macchine vettoriali di supporto (SVM)11 sono modelli spesso utilizzati sul campo e ciascuno presenta diverse considerazioni statistiche. Di conseguenza, è necessario eseguire la pre-elaborazione dei dati. Usare l’apprendimento automatico che si adatta agli obiettivi sperimentali. Qui, una proiezione sul modello di struttura latente (PLS) viene costruita utilizzando la regione di impronte spettrali degli spettri Raman (600-1,710 cm-1)11,12. Media-centra i dati in base alle esigenze. Per la convalida incrociata del modello, è possibile applicare diverse tecniche.NOTA: Qui viene applicata una cross-validation cieca veneziana con 10 divisioni. La complessità del modello (numero di componenti o variabile latente) deve essere testata in modo che il modello migliore riduca al minimo il valore di errore quadrato medio radice (RMSE). Si è scoperto che tre vettori latenti (LV) hanno fornito la migliore discriminazione con il nostro set di dati. Identificare quali picchi spettrali Raman contribuiscono alla discriminazione delle cellule (ad esempio, tracciando il punteggio di importanza variabile nella proiezione [VIP] per ogni numero d’onda Raman o la grandezza del coefficiente di regressione).NOTE: Il punteggio VIP di una variabile viene calcolato come somma ponderata delle correlazioni al quadrato tra i componenti PLS-DA e la variabile originale. Dettagli per quanto riguarda PLS e VIP punteggi algoritmo possono essere trovati nella letteratura11,12. 5. Impostazione e procedure di campionamento a cella singola Fissare il sistema di campionamento cellulare sul microscopio di Raman, come illustrato nella Figura 1. Collegare il micromanipolatore 3D al supporto capillare di vetro collegato a una siringa vuota per succhiare il campione applicando una pressione negativa (Figura 1). Impostare il microscopio su un campo di ingrandimento elevato (40x) per osservare la punta del vetro capillare e assicurarsi che non sia rotto. Controllare la posizione del vetro capillare utilizzando il micromanipolatore (x-, y-, z-axes). Assicurarsi che la punta capillare sia centrata nel campo visivo, quindi spostare il capillare sull’asse z per dare spazio al piatto di coltura in un secondo momento.NOTA: Il microcampionamento delle cellule viene eseguito dal capillare del vetro per le cellule con diametri compresi tra 10-15 m. Si raccomanda un capillare di dimensioni del foro di 5 m. Se la dimensione del foro è troppo piccola, la punta capillare sarà tappata dalla cellula, e se è troppo grande, la sensibilità delle successive misurazioni della SM potrebbe essere compromessa. Posizionare la piastra/piatto campione sullo stage del microscopio, regolare l’ingrandimento e mettere a fuoco, selezionare la cella di destinazione sulla piastra della griglia e spostarla al centro della vista. Quindi, abbassare con attenzione il vetro capillare utilizzando micromanipolatore (asse z) fino a quando la punta entra a fuoco.NOTA: Assicurarsi di non spostare il capillare negli assi x e y fino a quando il capillare non è a fuoco. Sotto osservazione microscopica, toccare la singola cellula bersaglio con la punta capillare, quindi iniziare ad applicare una pressione negativa utilizzando la siringa per intrappolare la cellula all’interno della punta capillare. Registrare questa procedura scattando una foto o un video per controllare con precisione la tempistica e la posizione della cella, se necessario. Spostare il capillare verso l’alto sull’asse z. Quindi, staccare il capillare dal supporto capillare utilizzando pinze in preparazione per l’analisi MS. 6. Misurazioni della spettrometria di massa Calibrare la precisione di massa dello strumento MS secondo le raccomandazioni del produttore. Dopo la calibrazione, assicurarsi che l’errore di massa non sia maggiore di 3 ppm. Ottimizzare lo strumento MS a parametri più adatti per l’analita di interesse.NOTA: Nel caso di tamoxifene e 4-OHT analisi, i parametri dello strumento sono impostati sul seguente: ingresso capillare temperatura: 400 C, tensione a spruzzo: 1500 V, obiettivo di controllo automatico del guadagno (AGC): 5.00E-06, livello RF S-lens: 90%, gamma SIM: 347-397 m/z, Tempo massimo di iniezione SIM: 200 ms, risoluzione SIM: 140.000 FWHM, gamma MS/MS: 50-400 m/z, MS/MS AGC target: 2.00E-05, MS/MS tempo massimo di iniezione: 100 ms, risoluzione MS/MS: 17,500 FWHM, MS/MS finestra di isolamento: 1 m/z, MS/MS(MS). Impostare un metodo di acquisizione automatica con una durata di 5 min per la modalità SIM per ottenere la quantificazione relativa, e un altro metodo MS / MS per l’identificazione positiva del farmaco e il suo metabolita. I parametri del metodo di acquisizione devono essere impostati sui valori ottimizzati indicati nel passaggio 6.2. Preparare il solvente per la ionizzazione sotto un cofano di fumi. La composizione del solvente dipende dall’analita di interesse. Qui, il solvente organico utilizzato è costituito da 80% MeOH, 10% DMSO, e 0.1% acido formico. Mescolare uno standard interno appropriato con il solvente organico prima delle misurazioni. In questo esperimento, 5,31 nM di d5-tamoxifene viene utilizzato come standard interno. Per evitare falsi positivi, aspirare i supporti che circondano le cellule trattate con il farmaco utilizzando un capillare di dimensioni 1 m con costante osservazione microscopica per evitare il campionamento di parti cellulari. Aggiungere 2 -L del solvente per ionizzazione all’estremità larga del capillare contenente il supporto utilizzando una pipetta attaccata alle punte del caricatore. Quindi, analizzare il supporto campionato dalla SM, verificare la presenza dell’analita di interesse (normalmente, non dovrebbe essere rilevabile). Aggiungere 2 – L il solvente di ionizzazione al capillare contenente la cellula, fissare il capillare a un adattatore nanoelettrospray (nano-ESI) collegato ad un adeguato spettrometro di massa e avviare il metodo di acquisizione automatica. 7. Elaborazione e analisi dei dati di spettrometria di massa NOTA: Qualsiasi software adatto può essere utilizzato per eseguire l’analisi dei dati. Tuttavia, se i ricercatori desiderano eseguire l’analisi dei dati utilizzando un software che non è fornito dal fornitore MS, quindi i dati grezzi devono essere convertiti dal formato fornitore proprietario in un formato aperto o come un file di testo prima (che è stato fatto qui). Normalizzare i dati dividendo l’area di picco dell’analita per quella dello standard interno dalla stessa scansione MS. Quindi, log trasformare i rapporti di picco per ridurre l’asimmetria. Tracciare l’intensità normalizzata del farmaco o del suo metabolita come boxplot o curva di densità per visualizzare la distribuzione tra singole cellule. Qui, viene utilizzato il software statistico R, insieme al pacchetto ggplot2. Calcolare il farmaco metabolizzato al rapporto farmacologico non metabolizzato dividendo l’abbondanza del metabolita del farmaco per quella della molecola genitore non metabolizzata in ogni cellula (cioè, 4-OHT e tamoxifene, rispettivamente.NOTA: La correlazione tra variazioni di specifici picchi di interesse Raman e le variazioni nei picchi di SM del farmaco o dei suoi metaboliti può essere studiata. Questa è un’aggiunta alla possibile correlazione tra il farmaco stesso e il suo metabolita in singole cellule. Questo può essere fatto calcolando il coefficiente di correlazione di Pearson utilizzando un test a due code. Dovrebbero essere presi in considerazione anche approcci integrativi più avanzati.