هذا البروتوكول يقدم متكاملة رامان الطيفي-كتله الطيف (MS) المنصة التي هي قادره علي تحقيق دقه خليه واحده. يمكن استخدام التحليل الطيفي لرامان لدراسة الاستجابة الخلوية للادويه ، في حين يمكن استخدام MS للتحليل الكمي والمستهدف لامتصاص المخدرات والأيض.
ومن المعروف ان الخلايا غير متجانسة بطبيعتها في ردودها علي المخدرات. ولذلك ، فانه من الضروري ان يتم احتساب تغاير أحاديه الخلية في دراسات اكتشاف المخدرات. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق قياس عدد كبير من التفاعلات الخلوية بين الخلية والمخدرات علي مستوي خليه واحده (اي امتصاص المخدرات ، والأيض ، والتاثير) بدقه. تصف هذه الورقة نظاما طيفيا أحادي الخلية من رامان والطيف الكتلي (MS) لرصد التغيرات الايضيه في الخلايا ردا علي المخدرات. باستخدام هذا النظام الأساسي ، يمكن قياس التغيرات الايضيه في الاستجابة للدواء بواسطة الطيفي رامان ، في حين ان المخدرات والمستقلب لها يمكن تحديدها كميا باستخدام الطيف الكتلي في نفس الخلية. وتشير النتائج إلى انه من الممكن الوصول إلى المعلومات حول امتصاص المخدرات, الأيض, والاستجابة علي مستوي خليه واحده.
تستجيب الخلايا بشكل مختلف للتغيرات في بيئتها الصغرى علي مستوي الخلية الواحدة ، وهي ظاهره تسمي التغاير الخلوي1. وعلي الرغم من هذا ، فان دراسات اكتشاف المخدرات الحالية تستند إلى قياسات متوسطه لسكان الخلايا ، والتي تشوش المعلومات حول السكانالفرعيين المحتملينوكذلك الاختلافات في الخلية الواحدة 2. قد تفسر هذه المعلومات المفقودة لماذا بعض الخلايا أكثر عرضه للادويه بينما البعض الآخر مقاوم. ومن المثير للاهتمام ، ان نقص المعلومات أحاديه الخلية عن الاستجابة للمخدرات هو سبب محتمل لفشل المرحلة الثانية التجارب السريرية للمخدرات3. لذلك ، لمعالجه هذه المشكلة ، يجب قياس التفاعلات الخلوية مع الدواء (اي ، الامتصاص ، الأيض ، والاستجابة) علي مستوي الخلية الواحدة.
ولتحقيق ذلك ، قمنا بتصميم نظام فريد من نوعه يتم فيه فحص الخلايا الحية الوحيدة باستخدام الطيف الطيفي رامان الخالي من التسمية ، ثم يتميز باستخدام الطيف الكتلي4. الطيفي رامان يوفر بصمه الجزيئية للدولة الخلوية, طيف معقده الناتجة عن مساهمات العديد من الجزيئات داخل الخلية. علي الرغم من هذا تعقيد, هو يستطيع كنت اعتبرت ان [رامان] بصمات يعكس بنيه خليه كامله وأيض5,6. الطيفي رامان تتفوق في قياس الدول الخلوية في طريقه الانتاجيه غير الغازية وعاليه نسبيا ، مما يجعل من المفيد لفحص وتقييم الاستجابة للمخدرات علي مستوي خليه واحده.
وعلي النقيض من ذلك ، توفر الMS الحساسية المطلوبة والانتقائية لقياس امتصاص المخدرات علي مستوي الخلية الواحدة. بما ان MS هو مدمر (يتم استهلاك عينه [خليه] عاده اثناء التحليل) ، ودمجها مع غير تدميري ، والتصنيف الطيفي رامان الخالية من التسمية يمكن ان توفر إنتاجيه عاليه ونظام حساس. هذه المنصة مجتمعه قادره علي توفير المزيد من المعلومات حول امتصاص المخدرات, الأيض, والآثار علي مستوي خليه واحده.
توضح هذه المخطوطة بروتوكولا يستخدم لدراسة التفاعلات الخلوية مع المخدرات علي مستوي الخلية الواحدة باستخدام الثقافات الانبوبيه باستخدام منصة رامان-MS متكاملة. للقيام بذلك ، يتم استخدام خلايا سرطان الخلية الكبدية (HepG2) و تاموكسيفين كنموذج. تم اختيار الخلايا HepG2 لأنها تاخذ تاموكسيفين واستقلاب المخدرات, وتتاثر في وقت واحد بسبب اثارها سميه كبديه. وتستخدم دولتان في هذه المخطوطة: الخلايا المعالجة بالمخدرات مقابل الخلايا غير المعالجة (السيطرة).
في هذه المخطوطة ، تم اختيار حاله بسيطه تعرضت فيها خلايا HepG2 (أو لا) لعقار تاموكسيفين. ومن الواضح ان قدره الطيفية رامان ونظام الطيف الكتلي لرصد اثار تاموكسيفين علي الخلايا. سمح الطيفي رامان تحديد المؤشرات الحيوية المحتملة التي تعكس استجابه عامه من خلايا واحده للتعرض للمخدرات. ولوحظ وجود بعض التباين بين الخلايا المفردة ، مما يوحي بان بعض الخلايا لا تستجيب للتعرض للمخدرات. ومن ناحية أخرى ، كانت اللجنة قادره علي اجراء تحليل مستهدف للدواء والمستقلب الخاص به علي مستوي الخلية الواحدة ، حيث لوحظت درجه عاليه من التغاير في المخدرات ووفره المستقلب. هذا التباين يساعد علي تفسير لماذا تتاثر بعض الخلايا من المخدرات في حين ان البعض الآخر علي ما يبدو لا, علي الرغم من الخلايا الناشئة من السكان موحده يفترض12.
ومن بين جوانب معينه من هذه التقنية التي تتطلب الاهتمام ، من المهم تقييم نوعيه المجهر الاعداد ومعالجه الإشارات لضمان استنساخ البيانات. إذا تم المعالجة المسبقة لأطياف بعناية ، وينبغي تعظيم الاختلافات اشاره في اقصي المحلية لكل ذروه. وعلي النقيض من ذلك ، ينبغي ان يتداخل خط الأساس وحافه الأطياف بين ظروف الخلايا المختبرة. وثمة جانب هام آخر هو النموذج المتعدد المتغيرات المستخدم للتحقيق في الاختلافات بين العلاجات. ويجب علي المرء ان يقيم بعناية النماذج والمعايير النموذجية لضمان تحليل دقيق ودقيق. ميزه واحده من نموذج الثابتة والمتنقلة ، علي عكس الشبكات العصبية ، هو انه يسمح بالوصول إلى الأوزان المرتبطة بكل الطول الموجي (النوبات رامان) التي تميز أفضل الظروف اختبارها من قبل النموذج.
علي الرغم من الطيف الطيفي رامان التمييز بنجاح الاستجابة للمخدرات, وينبغي التاكيد علي ان هذه التقنية محدوده في استخدامها لتوفير التفسير البيولوجي. ويرجع ذلك أساسا إلى تعقيد الاشاره الطيفية ، التي تشمل خليطا من آلاف الجزيئات. ولذلك ، يلزم اجراء مزيد من التحقيقات لتقييم الاختلافات المنهجية بين الكثافة الطيفية لرامان والاختلافات في تركيزات المخدرات. أيضا ، هناك حاجه إلى دراسات مماثله لخطوط الخلايا الأخرى لتقييم تعميم المؤشرات الحيوية الطيفية المرتبطة تاموكسيفين.
وعلاوة علي ذلك ، قد يكون من المهم اجراء قياسات الانسجه الحية لتقييم الدوائي ودراسة كيفيه تغلغل المخدرات وتدفقها داخل كل خليه. وعلاوة علي ذلك ، تجدر الاشاره إلى ان خطوه أخذ العينات في المركز المذكور تعتمد إلى حد كبير علي مهارة المشغل. المعلمات مثل الدقة المكانية ، ووضع الخلية داخل الشعرية بعد أخذ العينات ، وقوه الانتاجيه هي بالبالكامل المشغل التابعة ، والتي تحد من اعتماد واسعه النطاق من LSC-MS. وعلي الرغم من ان نظم أخذ العينات المؤتمتة قد تخفف من هذه المسالة. وعلاوة علي ذلك ، في حين تتفوق LSC-MS في أخذ العينات الملتصقة أو الخلايا العائمة في الدول الاصليه ، فانه يؤدي أكثر سوءا في الخلايا أخذ العينات جزءا لا يتجزا من أقسام الانسجه. ويرجع ذلك إلى ميل الشعيرات الشعرية العينة لكسر إذا كانت كثافة العينة عاليه. ولذلك ، فان نهجا آخر مثل التحقيق الوحيد قد يكون أكثر ملاءمة في مثل هذه الحالات14،15.
منذ يتم أخذ عينات من الخلايا المستخدمة هنا في الظروف المحيطة مع الحد الأدنى من اعداد العينة ، يمكن دمج LSC-MS بسهوله مع التكنولوجيات الأخرى ، كما هو مبين من خلال دمجها مع رامان في هذا البروتوكول. وقد سمح تكامل مماثل آخر مع التصوير الثلاثي الابعاد لتحقيق الكمية المطلقة من نواتج الأيض الخلوية علي مستوي الخلايا الفرعية16. بالاضافه إلى ذلك, التكامل مع تدفق الخلوي سمح للكشف عن المؤشرات الحيوية الايضيه في واحده الخلايا السرطانية المنتشرة من مرضي السرطان الورم الارومي العصبي17,18.
وفي المستقبل ، وبسبب الاهتمام المتزايد مؤخرا بالجمع بين مجموعات البيانات من طرائق التصوير19، قد يكون من المهم أيضا دراسة الاختلافات المنهجية بين إشارات رامان ونتائج قياس الطيف الكتلي (بالاضافه إلى أساليب القياس الأخرى) باستخدام النهج الحسابية التكاملية. ومن المثير للاهتمام ، لقد وجدنا بالفعل العديد من الارتباطات الخطية الضعيفة ولكن الهامه بين كثافة القمم رامان التي حددتها درجات كبار الشخصيات ووفره من تاموكسيفين أو المستقلب في مستوي خليه واحده كما حددت MS4. قد تشير هذه البيانات إلى وجود علاقة ايضيه بين ملفات تعريف MS وأطياف رامان وامكانيه التنبؤ بهذه القيم.
The authors have nothing to disclose.
ويشكر المؤلفون توشيو ياناغيدا علي دعمه والصناديق التعاونية الداخلية المنسوبة إلى الدكتور أرنو جيرموند.
0.1% penicillin-streptomycin | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
35mm glass bottom grid dish | Matsunami | ||
4-Hydroxy Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 94873 | |
532 nm diode pumped solid-state laser | Ventus, Laser Quantum | ||
BIOS-L101T-S motorized microscope stage | OptoSigma | ||
CT-2 cellomics coated sampling capillaries | HUMANIX | ||
d5-Tamoxifen standard | Cambridge Isotope Laboratories | ||
Dimethyl sulfoxide LC-MS grade | Nacalai Tesque | D8418 | |
Dulbecco's Modified Eagle's medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Eppendorf GELoader tips | Eppendorf | ||
fetal bovine serum | Hyclone laboratories | SH3006603 | |
FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | ||
Formic acid LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 33015 | |
HepG2 cell line (RCB1886) | RIKEN cell bank center | RCB1886 | |
MC0-19A1C Incubator | Sanyo Electric Co. | MC0-19A1C | |
Methanol LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 1060352500 | |
MMO-203 3-D Micromanipulator | Narshige | MMO-203 | |
NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens | Olympus | ||
Nanoflex nano-ESI adaptor | Thermo Fisher Scientific | ES071 | |
On-stage incubator | ibidi | ||
Pierce LTQ Velos ESI calibration solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | |
PIXIS BR400 cooled CCD camera | Princeton Instruments | ||
Q-Exactive Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | ||
Rat-tail collagen coating solution | Cell Applications Inc. | ||
Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 85256 |