Una plataforma integrada de espectroscopia y espectrometría de masas de Raman para estudiar la admisión, el metabolismo y los efectos de fármacos de una sola célula

1. Cultivo celular Células de cultivo de interés en un medio de cultivo adecuado. Se puede añadir penicilina-estreptomicina para evitar la contaminación. En el caso de las células HepG2, las células de cultivo de un medio de cultivo que contiene el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) se complementan con un 10% de suero bovino fetal (FBS) y un 0,1% de penicilina-estreptomicina. Para facilitar las mediciones de espectroscopia de Raman, las células se pueden cultivar en un plato con fondo de vidrio recubierto de gelatina del 0,1%o en diapositivas de cuarzo. Incubar células durante 2 días a 37oC y 5%co2 en una incubadora humidificada. Sincronizar cultivos celulares para alcanzar el 70% de confluencia. Las células de subcultivo en una placa de rejilla de vidrio-inferior de 35 mm o diapositivas de cuarzo utilizando el mismo medio a una densidad de semillas de 0.7 x 106,luego incuban a 37 oC durante 24 h.NOTA: Los platos o toboganes de cultivo se pueden pre-recubrir con solución de recubrimiento de colágeno o gelatina con una relación de superficie de cultivo de 5 ug/cm2 para permitirles fijarlos, asegurando su supervivencia durante la medición. 2. Tratamiento farmacológico Retire los cultivos celulares de la incubadora y lave 2 veces con el tampón de PBS precalentado (37 oC).NOTA: Es óptimo eliminar las células para el tratamiento farmacológico con una confluencia del 50%-60%. Divida las células en subgrupos tratados con drogas y no tratados en platos de cultivo de 35 mm. Mezclar la droga de elección con los medios de cultivo. Por ejemplo, disolver tamoxifeno en dimetil sulfóxido (DMSO) y mezclar con los medios de cultivo para obtener un volumen final de 2 ml y concentración de tamoxifeno de 10 m. Este será el grupo tratado con drogas. Mezclar un volumen correspondiente de disolvente (DMSO) en el medio como un control para estudiar los efectos de DMSO. Este será el grupo de control. Incubar ambos grupos en 2 ml de los medios espigados preparados en los pasos 2.3-2.4 para 24 h. La confluencia esperada después de la incubación debe ser del 70%-80%. 3. Imágenes espectrales de Raman y procesamiento espectral NOTA: Aunque los sistemas de espectroscopia Raman están disponibles comercialmente, el sistema de espectroscopia Raman utilizado aquí es un microscopio confocal de escaneo de línea casero descrito anteriormente7,8. En resumen, este sistema está equipado con un láser de estado sólido bombeado por diodo de 532 nm. La luz láser se forma en un plano utilizando una lente cilíndrica, que permite la medición de 400 espectros en una sola exposición. Los espectros de Raman se grabaron utilizando una cámara CCD enfriada montada en un policromator que utiliza una rejilla de 1.200 ranuras/mm para maximizar la resolución espectral de la región de huellas dactilares (de 500-1.800 cm-1). Esta área espectral contiene una alta densidad de frecuencias específicas de las moléculas que genera dispersión de Raman. También se utiliza una lente de inmersión en agua (NA a 0,95). La resolución espacial de este sistema es de 300 nm y la resolución espectral es de 1 cm-1. Para garantizar la supervivencia celular durante el experimento, se utiliza una microcámara fijada en una etapa motorizada del microscopio. Antes de las mediciones espectrales, verifique la alineación de la óptica. Se puede utilizar un agujero de 50 m para verificar que el agujero y la posición del láser coincidan exactamente. Introduzca la ranura del espectrofotómetro cuando se estremece tanto como sea posible. Utilice etanol para calibrar el espectrofotómetro antes de cada experimento. Para ello, coloque EtOH en un plato con fondo de vidrio, mida el espectro a una intensidad de láser determinada (medida en la muestra) durante 1 s y asocie el pico a longitudes de onda conocidas7. Minimice la intensidad del láser en la muestra a 2,4 mW/m2 para que las células sobrevivan a la exposición al láser. Poner la microcámara a 5% de CO2 y 37 oC. Una vez que el sistema de microscopio esté listo, retire las células de la incubadora y enjuague inmediatamente las células 2 veces con el tampón de PBS caliente (37 oC), luego agregue 2 ml de PBS calentado (37 oC) o DMEM para resuspender las células.NOTA: Tanto los medios basados en PBS como los basados en FluoroBrite DMEM son opciones suficientes para las mediciones de espectroscopia de Raman porque producen una señal de fondo mínima. Agregue 10 ml de agua a la lente objetivo de inmersión en agua y coloque delicadamente la placa celular con fondo de vidrio en la etapa del microscopio. Mida cada celda enfocando la línea láser. Un tiempo de exposición de 15 s por célula es suficiente aquí para obtener una sección transversal de una célula con una señal Raman clara. Un espejo galvano permite escanear una célula o un grupo de células dentro de varias docenas de minutos.NOTA: Una mayor resolución de las imágenes espectrales completas de las células requiere más tiempo y puede provocar fotodaños. Aquí, las células se midieron usando una exposición de una sola línea para obtener una sección transversal de cada célula. Este enfoque es un buen equilibrio para aumentar el rendimiento y obtener información suficiente para discriminar las células, al mismo tiempo que se garantiza la viabilidad celular al limitar el daño fotográfico. 4. Preprocesamiento de datos espectrales y análisis multivariados NOTA: El preprocesamiento es un paso necesario antes del análisis adicional para eliminar las variaciones técnicas no deseadas dentro de los datos espectrales. Debido a la diversidad de los métodos y software, no se puede proporcionar una lista exhaustiva, y hay muchos comentarios útiles que se encuentran en la literatura7,8. En esta sección, describimos brevemente el enfoque utilizado para analizar e interpretar los datos espectrales de Raman obtenidos de células individuales vivas. Extraiga y preprocesar imágenes Raman para eliminar posibles interferencias de rayos cósmicos.NOTA: El eje espectral de los espectros obtenidos durante diferentes días/semanas/meses puede incluir algunas variaciones debido a pequeñas variaciones técnicas durante la calibración con etanol. Esto afectará fuertemente a los análisis multivariados subsiguientes y a las comparaciones estadísticas. En el caso de que los experimentos se realicen durante diferentes semanas/meses, se esperan pequeñas variaciones ópticas. En este caso, los datos deben interpolarse para corregir los desplazamientos espectrales eventuales de los datos entre experimentos. La interpolación mediante spline cúbica se utiliza aquí. Después de este paso, todos los ejes de espectros deben estar alineados. Se considera un rango de 500-1,800 cm-1 para su posterior análisis. Extraiga datos espectrales de celdas y fondo (ausencia de celdas) de cada imagen utilizando un algoritmo casero. Restar la señal de fondo de la señal de la celda. A continuación, promediar los espectros de los píxeles restantes, que deben corresponder a una sola celda. Los siguientes pasos se realizan utilizando los espectros 2D de las células. Realice una corrección de línea base utilizando el ModPoly9 o cualquier otro algoritmo que se estima que se ajuste lo suficiente. Recortar el rango espectral a 600-1,700 cm-1 para seleccionar la región de la huella digital y asegurarse de que no hay efectos de borde no deseados en los espectros debido a un mal ajuste polinómico. Realizar un paso de normalización como la normalización vectorial (la intensidad en cada número de onda se divide por la norma l2 global o el valor singular máximo de un espectro) para normalizar la intensidad espectral10,aunque se pueden considerar otras normalizaciones. Prepare un conjunto de datos con la etiqueta adecuada para cada clase o condición.NOTA: Se pueden perforar análisis espectrales comparativos para explorar la naturaleza de las posibles diferencias entre la clase/condiciones de las células (por ejemplo, restando el espectro medio del grupo de control a otros grupos para identificar regiones de interés [como biomarcadores potenciales]). Los cálculos de puntuaciones ANOVA y Fisher también se pueden realizar10. Para identificar las células tratadas y no tratadas en función de las entidades espectrales, se pueden aplicar análisis multivariados. Los datos espectrales normalizados se deben utilizar como conjunto de datos de entrenamiento y se debe usar un conjunto de datos desconocido (sin etiqueta) de un experimento de réplica como datos de prueba, si es posible.NOTA: El análisis discriminatorio realizado en algún vector de un análisis de componentes principales (PCA-DA10),la proyección en puntuaciones latentes seguida de el análisis discriminante (PLS-DA) y las máquinas vectoriales de soporte (SVM)11 son modelos que se utilizan a menudo en el campo, y cada uno presenta diferentes consideraciones estadísticas. En consecuencia, se debe realizar el preprocesamiento de los datos. Utilice el aprendizaje automático que se ajuste a los objetivos experimentales. Aquí, se construye una proyección sobre el modelo de estructura latente (PLS) utilizando la región de huellas dactilares espectrales de los espectros Raman (600-1,710 cm-1)11,12. Centrar los datos según sea necesario. Para la validación cruzada del modelo, se pueden aplicar diferentes técnicas.NOTA: Aquí se aplica una validación ciega veneciana con 10 divisiones. La complejidad del modelo (número de componentes o variable latente) se debe probar para que el mejor modelo minimice el valor de error cuadrado medio raíz (RMSE). Se encontró que tres vectores latentes (LV) proporcionaban la mejor discriminación con nuestro conjunto de datos. Identificar qué picos espectrales de Raman contribuyen a la discriminación de las células (por ejemplo, trazando la puntuación de importancia variable en la proyección [VIP] para cada número de onda de Raman o la magnitud del coeficiente de regresión).NOTA: La puntuación VIP de una variable se calcula como una suma ponderada de las correlaciones cuadradas entre los componentes PLS-DA y la variable original. Los detalles sobre PLS y VIP scores algoritmo se pueden encontrar en la literatura11,12. 5. Configuración y procedimientos de muestreo de una sola célula Fije el sistema de muestreo celular en el microscopio Raman como se muestra en la Figura 1. Conecte el micromanipulador 3D al soporte capilar de vidrio que está unido a una jeringa vacía para la succión de muestras aplicando presión negativa(Figura 1). Ajuste el microscopio a un campo de aumento alto (40x) para observar la punta del capilar de vidrio y asegurarse de que no esté roto. Controle la posición del capilar de vidrio utilizando el micromanipulador (x-, y-, z-axes). Asegúrese de que la punta capilar esté centrada en el campo de visión, luego mueva el capilar hacia arriba en el eje z para dar espacio libre para el plato de cultivo más adelante.NOTA: El micromuestreo de las células se realiza mediante el capilar de vidrio para células con diámetros entre 10-15 m. Se recomienda un capilar con un tamaño de agujero de 5 m. Si el tamaño del agujero es demasiado pequeño, la punta capilar será enchufada por la célula, y si es demasiado grande, la sensibilidad de las mediciones posteriores de la EP puede verse comprometida. Coloque la placa/plato de muestra en el escenario del microscopio, ajuste la ampliación y el enfoque, seleccione la celda de destino en el plato de la rejilla y muévala al centro de visión. Luego, baje cuidadosamente el capilar de vidrio usando micromanipulador (eje z) hasta que la punta entre en foco.NOTA: Asegúrese de no mover el capilar en los ejes X e Y hasta que el capilar esté enfocado. En observación microscópica, toque la célula única objetivo con la punta capilar y, a continuación, comience a aplicar presión negativa utilizando la jeringa para atrapar la célula dentro de la punta capilar. Grabe este procedimiento tomando una foto o un video para comprobar el tiempo y la ubicación aspirada de la celda con precisión, si es necesario. Mueva el capilar hacia arriba en el eje z. A continuación, separar el capilar del soporte capilar utilizando fórceps en preparación para el análisis de EM. 6. Mediciones de espectrometría de masas Calibre la precisión de masa del instrumento MS de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Después de la calibración, asegúrese de que el error de masa no sea superior a 3 ppm. Optimice el instrumento MS a los parámetros que mejor se adapten al analito de interés.NOTA: En el caso del tamoxifeno y el análisis 4-OHT, los parámetros del instrumento se establecen en lo siguiente: temperatura capilar de entrada: 400 oC, voltaje de pulverización: 1500 V, objetivo de control de ganancia automática (AGC): 5.00E+06, nivel de RF De lente S: 90%, rango SIM: 347-397 m/z, tiempo de inyección máximo SIM: 200 ms, Resolución SIM: 140.000 FWHM, rango MS/MS: 50-400 m/z, mS/MS AGC objetivo: 2.00E+05, MS/MS tiempo máximo de inyección: 100 ms, resolución MS/MS: 17.500 FWHM, ventana de aislamiento MS/MS: 1 m/z, MS/MS energía de colisión normalizada (NCE 35): Configure un método de adquisición automática con una duración de 5 min para el modo SIM para lograr una cuantificación relativa, y otro método MS/MS para la identificación positiva del fármaco y su metabolito. Los parámetros del método de adquisición deben establecerse en los valores optimizados mencionados en el paso 6.2. Prepare el disolvente de ionización bajo una campana de humos. La composición del disolvente depende del analito de interés. Aquí, el disolvente orgánico utilizado consiste en 80% MeOH, 10% DMSO, y 0.1% ácido fórmico. Mezclar un estándar interno adecuado con el disolvente orgánico antes de las mediciones. En este experimento, 5.31 nM de d5-tamoxifeno se utiliza como un estándar interno. Para evitar falsos positivos, aspirar los medios que rodean las células tratadas con el fármaco utilizando un capilar de tamaño de diámetro de 1 m con observación microscópica constante para evitar el muestreo de cualquier parte celular. Añadir 2 l del disolvente de ionización al extremo ancho del capilar que contiene el medio utilizando una pipeta unida a las puntas del cargador. A continuación, analizar los medios muestreados por EM, comprobar la presencia del analito de interés (normalmente, no debe ser detectable). Añadir el disolvente de ionización de 2 l al capilar que contiene la célula, fijar el capilar a un adaptador de nanoelectrospray (nano-ESI) conectado a un espectrómetro de masas adecuado e iniciar el método de adquisición automática. 7. Procesamiento y análisis de datos de espectrometría de masas NOTA: Cualquier software adecuado se puede utilizar para realizar análisis de datos. Sin embargo, si los investigadores desean realizar el análisis de datos utilizando un software que no es proporcionado por el proveedor de MS, entonces los datos sin procesar deben convertirse del formato de proveedor propietario a un formato abierto o como un archivo de texto primero (que se hizo aquí). Normalice los datos dividiendo el área pico del analito de interés por el del estándar interno de la misma exploración MS. A continuación, el registro transforma las proporciones de pico para reducir la asimetría. Trazar la intensidad normalizada de la droga o su metabolito como una gráfica de caja o curva de densidad para visualizar la distribución a través de células individuales. Aquí, se utiliza el software estadístico R, junto con el paquete ggplot2. Calcular la proporción de fármaco sin metabolizar a fármaco no metabolizado dividiendo la abundancia del metabolito del fármaco por la de la molécula madre no metabolizada en cada célula (es decir, 4-OHT y tamoxifeno, respectivamente.NOTA: Se puede estudiar la correlación entre las variaciones de los picos específicos de interés de Raman y las variaciones en los picos de EM de la droga o sus metabolitos. Esta es una adición a la posible correlación entre la droga en sí y su metabolito en células individuales. Esto se puede hacer calculando el coeficiente de correlación de Pearson utilizando una prueba de dos colas. También deben considerarse enfoques integradores más avanzados.