פרוטוקול זה מציג את פלטפורמת משולבת ראמאן ספקטרוסקופית (MS) של המסה המסוגלת להשיג רזולוציה של תא בודד. ספקטרוסקופית ראמאן ניתן להשתמש כדי ללמוד תגובה תאית לסמים, בעוד MS יכול לשמש ניתוח ממוקד וכמותי של ספיגת התרופה ואת חילוף החומרים.
תאים ידועים להיות הטרוגנית מיסודו בתגובותיהם לסמים. לכן, חיוני כי תא בודד טרוגניות במחקרים גילוי סמים. זה יכול להיות מושגת על ידי מדידת מדויק של שפע של אינטראקציות סלולריות בין תא לבין תרופה ברמה תא יחיד (כלומר, ספיגת הסמים, חילוף החומרים, והתוצאה). המאמר מתאר את הפלטפורמה היחידה לניטור מטבולית של תאים בעלי תא יחיד ולנטר שינויים מטבוליים בתגובה לתרופות. באמצעות פלטפורמה זו, שינויים מטבולית בתגובה לתרופה ניתן למדוד על ידי ספקטרוסקופיית ראמאן, בעוד התרופה ואת המטבולית שלה ניתן לכמת באמצעות ספקטרומטר מסה באותו תא. התוצאות מרמזות על כך שניתן לגשת למידע אודות ספיגת הסמים, חילוף החומרים והתגובה ברמה של תא בודד.
תאים מגיבים באופן שונה לשינויים בסביבת המיקרו-שלהם ברמת התא הבודד, תופעה הנקראת טרוגניות סלולר1. למרות זאת, המחקרים הנוכחיים של גילוי הסמים מבוססים על מדידות ממוצעות של אוכלוסיות תאים, אשר מערפל מידע על אוכלוסיות משנה פוטנציאליות, וכן וריאציות של תא בודד2. מידע חסר זה עשוי להסביר מדוע תאים מסוימים רגישים יותר לסמים בעוד אחרים עמידים. מעניין, היעדר מידע תא יחיד על תגובת התרופה היא סיבה אפשרית לכישלון הניסויים הקליניים שלב II של תרופות3. לכן, כדי לטפל בבעיה זו, יש למדוד את האינטראקציות הסלולריות עם הסם (כלומר, ספיגת, חילוף החומרים והתגובה) ברמת התא היחיד.
כדי להשיג זאת, עיצבנו מערכת ייחודית שבה החיים תאים בודדים מוקרנים באמצעות התווית ספקטרוסקופית ראמאן לאחר מכן מאופיין עוד יותר באמצעות ספקטרומטר מסה4. ספקטרוסקופיית ראמאן מספק טביעת אצבע מולקולרית של המדינה התאית, ספקטרום מורכב הנובע מהתרומות של מולקולות רבות בתוך התא. למרות מורכבות זו, זה יכול להיחשב כי טביעות אצבע ראמאן משקפים מבנה של תא שלם חילוף חומרים5,6. הספקטרוסקופית ראמאן מצטיינת במדידת מצבים סלולאריים בצורה של תפוקה לא פולשנית וגבוהה יחסית, מה שהופך אותו לשימושי להקרנה ולהערכת תגובת הסמים ברמת התא היחיד.
לעומת זאת, MS מספק את הרגישות הנדרשת ואת הסלקטיביות למדידת ספיגת התרופה ברמה תא יחיד. מאז MS היא הרסנית (המדגם [תא] הוא נצרך בדרך כלל במהלך הניתוח), שילוב זה עם גמישה, תווית הספקטרוסקופית ראמאן יכול לספק תפוקה גבוהה ומערכת רגישה. פלטפורמה זו משולבת מסוגל לספק מידע נוסף על ספיגת הסמים, חילוף החומרים, ואפקטים ברמה תא יחיד.
כתב יד זה מהבהיר פרוטוקול המשמש לחקר אינטראקציות סלולריות עם סמים ברמה של תא יחיד באמצעות תרביות מבחנה באמצעות פלטפורמת ראמאן-MS משולבת. לשם כך, תאי קרצינומה של hepatocellular (HepG2) ו טמוקסיפן משמשים כמודל. תאים HepG2 נבחרו משום שהם לוקחים את טמוקסיפן מטבוליזם התרופה, והם מושפעים בו בשל ההשפעות hepatotoxic שלה. שתי מדינות משמשות בכתב יד זה: תאים שטופלו בסמים לעומת תאים שאינם מטופלים (בקרה).
בכתב היד הזה, נבחר מקרה פשוט שבו HepG2 תאים נחשפו (או לא) לטמוקסיפן. היכולת של ספקטרוסקופיית ראמאן ומערכת ספקטרומטר המסה ממחישה כדי לפקח על ההשפעות של טמוקסיפן על התאים. ספקטרוסקופיית ראמאן מאפשר זיהוי של סמנים פוטנציאליים שיקפו תגובה כללית של תאים בודדים לחשיפה לסמים. כמה טרוגניות בין תאים בודדים נצפתה, טוען כי כמה תאים לא הגיבו לחשיפה לסמים. מצד שני, LSC-MS היה מסוגל לבצע ניתוח ממוקד של התרופה ואת מטבוליזם שלה ברמה תא בודד, שבו רמה גבוהה של טרוגניות נצפתה בתרופה ואת השפע מטבוליזם שלה. טרוגניות זה עוזר להסביר מדוע תאים מסוימים מושפעים התרופה בעוד אחרים הם לכאורה לא, למרות התאים שמקורם באוכלוסייה אחידה לכאורה12.
בין היבטים מסוימים של טכניקה זו הדורשת תשומת לב, חשוב להעריך את איכות הגדרת המיקרוסקופ ועיבוד האותות כדי להבטיח את הנתונים. אם עיבוד מקדים של הספקטרום מתבצע בקפידה, יש להגדיל את וריאציות האות במקסימום של כל שיא. לעומת זאת, הבסיס והקצה של הספקטרום צריכים לחפוף בין תנאי התא שנבדקו. היבט חשוב נוסף הוא מודל רב-משתנים המשמש לחקר הבדלים בין טיפולים. יש להעריך בקפידה את המודלים ואת פרמטרי המודל כדי להבטיח ניתוח מדויק ומדויק. אחד היתרונות של המודל PLS, בניגוד לרשתות עצביות, הוא שזה מאפשר גישה למשקולות הקשורות לכל אורך הגל (ראמאן משמרות) הבחנה הטובה ביותר את התנאים נבדק על ידי המודל.
למרות הספקטרוסקופית ראמאן מפלה בהצלחה את תגובת התרופה, יש להדגיש כי טכניקה זו מוגבלת בשימוש בה כדי לספק פרשנות ביולוגית. זה נובע בעיקר המורכבות של האות ספקטרלי, אשר כוללת תערובת של אלפי מולקולות. לפיכך, נדרשת חקירה נוספת להערכת וריאציות שיטתית בין עוצמות ווריאציות ספקטרליות של ראמאן בריכוזים של סמים. כמו כן, מחקרים דומים של קווי תאים אחרים נדרשים להעריך את ההכללה של סמנים ספקטרלי הקשורים טמוקסיפן.
יתר על כן, זה עשוי להיות עניין לבצע מדידות רקמות החיים כדי להעריך פרמקודינמיקה וללמוד כיצד סמים לחדור ולזרום בתוך כל תא. יתרה מזאת, יש לציין כי צעד הדגימה ב-LSC-MS תלוי מאוד במיומנות של המפעיל. פרמטרים כגון רזולוציה מרחבית, מיקום התא בתוך נימי לאחר הדגימה, וחוזק התפוקה הם לגמרי תלויים, אשר מגביל את האימוץ בקנה מידה גדול של LSC-MS. למרות שמערכות דגימה אוטומטיות עשויות להקל על הבעיה. יתר על כן, בעוד LSC-MS מצטיין בדיגום מחסיד או תאים צפים במדינות הילידים שלהם, היא מבצעת גרוע יותר בתאי דגימה מוטבע בסעיפים רקמות. הדבר נובע מהנטייה של עצה נימי הדגימה להישבר אם צפיפות המדגם גבוהה. לכן, גישה נוספת כגון בדיקה בודדת עשויה להיות מתאימה יותר במקרים כאלה14,15.
מאז התאים המשמשים כאן הם שנדגמו בתנאי הסביבה עם הכנה לדוגמה מינימלית, LSC-MS ניתן לשלב בקלות עם טכנולוגיות אחרות, כפי שמוצג על ידי שילוב שלה עם ראמאן בפרוטוקול זה. שילוב דומה נוסף עם הולוגרפיה תלת-ממדית מאפשר להשיג כימות מוחלטות של מטבוליטים סלולאריים ברמה התאית16. בנוסף, שילוב עם cy, הזרמת ביוטונסה אפשרה לגלות ביואריטים מטבולית בתאים סרטניים במחזור בודדים של חולי סרטן נוירובלסטומה17,18.
בעתיד, בשל ההתעניינות הגוברת האחרונה בשילוב מערכות נתונים מדפוסי הדמיה19, זה עשוי להיות גם עניין ללמוד את הווריאציות הסיסטמיות בין אותות ראמאן לבין תוצאות ספקטרומטר המסה (כמו גם שיטות אחרות omics) באמצעות גישות חישוביות אינטגרטיבית. מעניין, כבר מצאנו כמה חלשים אך משמעותיים ליניארי היחסים בין העוצמות של פסגות ראמאן מזוהה על ידי ציוני VIP שפע של טמוקסיפן או מטבוליזם שלה ברמה תא יחיד כפי שזוהה על ידי MS4. נתונים אלה עשויים להציע קשר מטבולי בין פרופילי MS וספקטרום ראמאן והאפשרות לחזות ערכים אלה.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים טושיו Yanagida על תמיכתו ו RIKEN קרנות שיתוף פעולה פנימי המיוחס ד ר ארנו גרמונד.
0.1% penicillin-streptomycin | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
35mm glass bottom grid dish | Matsunami | ||
4-Hydroxy Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 94873 | |
532 nm diode pumped solid-state laser | Ventus, Laser Quantum | ||
BIOS-L101T-S motorized microscope stage | OptoSigma | ||
CT-2 cellomics coated sampling capillaries | HUMANIX | ||
d5-Tamoxifen standard | Cambridge Isotope Laboratories | ||
Dimethyl sulfoxide LC-MS grade | Nacalai Tesque | D8418 | |
Dulbecco's Modified Eagle's medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Eppendorf GELoader tips | Eppendorf | ||
fetal bovine serum | Hyclone laboratories | SH3006603 | |
FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | ||
Formic acid LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 33015 | |
HepG2 cell line (RCB1886) | RIKEN cell bank center | RCB1886 | |
MC0-19A1C Incubator | Sanyo Electric Co. | MC0-19A1C | |
Methanol LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 1060352500 | |
MMO-203 3-D Micromanipulator | Narshige | MMO-203 | |
NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens | Olympus | ||
Nanoflex nano-ESI adaptor | Thermo Fisher Scientific | ES071 | |
On-stage incubator | ibidi | ||
Pierce LTQ Velos ESI calibration solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | |
PIXIS BR400 cooled CCD camera | Princeton Instruments | ||
Q-Exactive Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | ||
Rat-tail collagen coating solution | Cell Applications Inc. | ||
Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 85256 |