Dit protocol presenteert een geïntegreerde Ramanspectroscopie-massaspectrometrie (MS) platform dat is geschikt voor het bereiken van één-cel resolutie. Raman-spectroscopie kan worden gebruikt om cellulaire reactie op drugs te bestuderen, terwijl MS kan worden gebruikt voor gerichte en kwantitatieve analyse van de opname van geneesmiddelen en metabolisme.
Cellen zijn bekend dat ze inherent heterogeen zijn in hun reacties op drugs. Daarom is het essentieel dat de heterogeniteit van één cel wordt verantwoord in onderzoeken naar geneesmiddelen ontdekking. Dit kan worden bereikt door het nauwkeurig meten van de overvloed aan cellulaire interacties tussen een cel en drug op het niveau van één cel (dat wil zeggen, drug opname, metabolisme, en effect). Dit artikel beschrijft een single-cell Ramanspectroscopie en massaspectrometrie (MS) platform om metabolische veranderingen van cellen in reactie op drugs te controleren. Met behulp van dit platform, metabole veranderingen in reactie op het medicijn kan worden gemeten door Raman-spectroscopie, terwijl de drug en de metaboliet kan worden gekwantificeerd met behulp van massaspectrometrie in dezelfde cel. De resultaten suggereren dat het mogelijk is om toegang te krijgen tot informatie over de opname van de drug, metabolisme, en reactie op een eencellige niveau.
Cellen reageren verschillend op veranderingen in hun micro omgeving op het eencellige niveau, een fenomeen dat cellulaire heterogeniteit1wordt genoemd. Ondanks dit, huidige Drug Discovery studies zijn gebaseerd op de gemiddelde metingen van de celpopulaties, die verdoezelen informatie over mogelijke subpopulaties, alsmede eencellige variaties2. Deze ontbrekende informatie kan verklaren waarom sommige cellen zijn gevoeliger voor drugs, terwijl anderen resistent zijn. Belangwekkend, het ontbreken van eencellige informatie over drug Response is een mogelijke reden voor het falen van fase II klinische proeven van drugs3. Daarom, om dit probleem op te lossen, cellulaire interacties met de drug (dat wil zeggen, opname, metabolisme, en reactie) moet worden gemeten op het niveau van de eencellige.
Om dit te bereiken, hebben we een uniek systeem ontworpen waarin levende enkelvoudige cellen worden gescreend met behulp van label vrije Raman-spectroscopie en vervolgens verder worden gekarakteriseerd met behulp van massaspectrometrie4. Raman-spectroscopie biedt een moleculaire vingerafdruk van de cellulaire toestand, een complex spectrum dat voortvloeit uit de bijdragen van vele moleculen in de cel. Ondanks deze complexiteit kan worden overwogen dat Raman-vingerafdrukken de structuur en de stofwisseling van een hele cel weerspiegelen,5,6. De Raman-spectroscopie blinkt uit in het meten van cellulaire toestanden op een niet-invasieve en relatief hoge doorvoer wijze, wat het nuttig maakt voor het screenen en beoordelen van de geneesmiddel respons op het eencellige niveau.
MS biedt daarentegen de vereiste gevoeligheid en selectiviteit voor het meten van de opname van geneesmiddelen op het eencellige niveau. Aangezien MS destructief is (het voorbeeld [cel] wordt meestal verbruikt tijdens de analyse), het integreren met niet-destructieve, label-vrije Raman-spectroscopie kan een hoge doorvoer en gevoelig systeem bieden. Dit gecombineerde platform is in staat om meer informatie te verstrekken over de opname van geneesmiddelen, metabolisme, en effecten op het niveau van de eencellige.
Dit manuscript verheldeert een protocol dat wordt gebruikt om cellulaire interacties met geneesmiddelen op het eencellige niveau te bestuderen met behulp van in vitro culturen door gebruik te maken van een geïntegreerd Raman-MS-platform. Om dit te doen, hepatocellulaire carcinoom cellen (HepG2) en Tamoxifen worden gebruikt als een model. HepG2 cellen werden gekozen omdat ze Tamoxifen nemen en metaboliseren de drug, en ze worden gelijktijdig getroffen als gevolg van de Hepatotoxische effecten. In dit manuscript worden twee toestanden gebruikt: met drugs behandelde cellen versus niet-behandelde cellen (controle).
In dit manuscript werd een simpele zaak gekozen waarin HepG2 cellen werden blootgesteld (of niet) aan Tamoxifen. Het vermogen van een Raman-spectroscopie en massaspectrometrie systeem wordt aangetoond dat het monitoren van de effecten van Tamoxifen op cellen. Raman-spectroscopie liet de identificatie van potentiële biomarkers zien die een algemene respons van enkelvoudige cellen tot blootstelling aan het geneesmiddel reflecteerde. Sommige heterogeniteit tussen enkele cellen werd waargenomen, wat suggereert dat sommige cellen niet reageerden op blootstelling aan geneesmiddelen. Aan de andere kant was LSC-MS in staat om een gerichte analyse van het medicijn en de metaboliet ervan op het eencellige niveau uit te voeren, waarbij een hoge mate van heterogeniteit werd waargenomen in het medicijn en de overvloed aan metaboliet. Deze heterogeniteit helpt verklaren waarom sommige cellen worden beïnvloed door het medicijn terwijl anderen schijnbaar niet zijn, ondanks de cellen die afkomstig zijn van een zogenaamd uniforme populatie12.
Onder bijzondere aspecten van deze techniek die aandacht vereisen, is het belangrijk om de kwaliteit van de Microscoop-opstelling en signaalverwerking te evalueren om de reproduceerbaarheid van de gegevens te garanderen. Als voor verwerking van de spectra zorgvuldig wordt gedaan, moeten de signaal variaties worden gemaximaliseerd op het lokale maximum van elke piek. De baseline en de rand van de spectra moeten daarentegen overlappen tussen de geteste celcondities. Een ander belangrijk aspect is het multivariate-model dat wordt gebruikt om verschillen tussen behandelingen te onderzoeken. Men moet de modellen en model parameters zorgvuldig evalueren om een nauwkeurige en nauwkeurige analyse te garanderen. Een voordeel van het PLS-model, in tegenstelling tot neurale netwerken, is dat het toegang geeft tot de gewichten die zijn gekoppeld aan elke golflengte (Raman shifts) die het beste de door het model geteste voorwaarden kunnen onderscheiden.
Ondanks dat de Raman-spectroscopie de reactie van de drug met succes heeft gediscrimineerd, moet worden benadrukt dat deze techniek beperkt is in het gebruik ervan om biologische interpretatie te bieden. Dit is vooral te wijten aan de complexiteit van het spectrale signaal, dat een mengsel van duizenden moleculen omvat. Daarom is verder onderzoek nodig om systematische variaties tussen Raman spectrale intensiteiten en variaties in geneesmiddelconcentraties te evalueren. Ook, soortgelijke studies van andere cellijnen zijn nodig om de generalisatie van spectrale biomarkers geassocieerd met tamoxifen te evalueren.
Bovendien, het kan van belang zijn voor het uitvoeren van levende weefsels metingen om de farmacodynamiek te beoordelen en te bestuderen hoe drugs doordringen en stromen binnen elke cel. Bovendien moet worden opgemerkt dat de bemonsterings stap in de LSC-MS sterk afhankelijk is van de vaardigheid van de exploitant. Parameters zoals ruimtelijke resolutie, celpositie binnen het capillair na bemonstering en doorvoer sterkte zijn volledig afhankelijk van de operator, waardoor grootschalige acceptatie van LSC-MS wordt beperkt. Hoewel geautomatiseerde bemonsteringssystemen dit probleem kunnen verlichten. Bovendien, terwijl LSC-MS blinkt uit bij het bemonsteren aanhangend of zwevende cellen in hun inheemse toestanden, het presteert meer slecht in monster cellen ingebed in weefsel secties. Dit is te wijten aan de neiging van de bemonstering capillaire tip te breken als de sample dichtheid hoog is. Daarom kan een andere benadering, zoals de enkelvoudige sonde, in dergelijke gevallen14,15geschikter zijn.
Aangezien de hier gebruikte cellen worden bemonsterd in omgevingscondities met een minimale monstervoorbereiding, kunnen LSC-MS eenvoudig worden geïntegreerd met andere technologieën, zoals blijkt uit de integratie met Raman in dit protocol. Een andere soortgelijke integratie met 3D-holografie heeft toegestaan voor het bereiken van absolute kwantatie van cellulaire metabolieten op het subcellulaire niveau16. Bovendien, integratie met Flow flowcytometrieonderzoeken heeft toegestaan voor het afdekken van metabole biomarkers in enkele circulerende tumorcellen van neuroblastoom kankerpatiënten17,18.
In de toekomst, als gevolg van recente toenemende belangstelling voor het combineren van datasets van Imaging modaliteiten19, kan het ook interessant zijn om de systematische variaties tussen Raman-signalen en massaspectrometrie resultaten (evenals andere omics-methoden) te bestuderen door gebruik te maken van integratieve computationele benaderingen. Interessant genoeg hebben we al verschillende zwakke, maar significante lineaire correlaties gevonden tussen de intensiteiten van Raman pieken geïdentificeerd door VIPSCORES en de overvloed van Tamoxifen of zijn metaboliet op het eencellige niveau zoals geïdentificeerd door MS4. Deze gegevens kunnen duiden op een metabole relatie tussen MS-profielen en Raman spectra en de mogelijkheid om deze waarden te voorspellen.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedanken Toshio Yanagida voor zijn steun en RIKEN interne samenwerkings fondsen toegeschreven aan Dr. Arno Germond.
0.1% penicillin-streptomycin | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
35mm glass bottom grid dish | Matsunami | ||
4-Hydroxy Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 94873 | |
532 nm diode pumped solid-state laser | Ventus, Laser Quantum | ||
BIOS-L101T-S motorized microscope stage | OptoSigma | ||
CT-2 cellomics coated sampling capillaries | HUMANIX | ||
d5-Tamoxifen standard | Cambridge Isotope Laboratories | ||
Dimethyl sulfoxide LC-MS grade | Nacalai Tesque | D8418 | |
Dulbecco's Modified Eagle's medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Eppendorf GELoader tips | Eppendorf | ||
fetal bovine serum | Hyclone laboratories | SH3006603 | |
FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | ||
Formic acid LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 33015 | |
HepG2 cell line (RCB1886) | RIKEN cell bank center | RCB1886 | |
MC0-19A1C Incubator | Sanyo Electric Co. | MC0-19A1C | |
Methanol LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 1060352500 | |
MMO-203 3-D Micromanipulator | Narshige | MMO-203 | |
NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens | Olympus | ||
Nanoflex nano-ESI adaptor | Thermo Fisher Scientific | ES071 | |
On-stage incubator | ibidi | ||
Pierce LTQ Velos ESI calibration solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | |
PIXIS BR400 cooled CCD camera | Princeton Instruments | ||
Q-Exactive Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | ||
Rat-tail collagen coating solution | Cell Applications Inc. | ||
Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 85256 |