Ce protocole présente une plate-forme intégrée de spectroscopie-masse de Raman (MS) qui est capable d’atteindre la résolution unicellulaire. La spectroscopie raman peut être utilisée pour étudier la réponse cellulaire aux médicaments, tandis que la SP peut être utilisée pour l’analyse ciblée et quantitative de l’utilisation et du métabolisme des médicaments.
Les cellules sont connues pour être intrinsèquement hétérogènes dans leurs réponses aux médicaments. Par conséquent, il est essentiel que l’hétérogénéité unicellulaire soit prise en compte dans les études de découverte de médicaments. Ceci peut être réalisé en mesurant avec précision la pléthore d’interactions cellulaires entre une cellule et un médicament au niveau d’une seule cellule (c.-à-d., l’utilisation de drogue, le métabolisme, et l’effet). Cet article décrit une plate-forme de spectroscopie et de spectrométrie de masse (MS) à cellule unique pour surveiller les changements métaboliques des cellules en réponse aux médicaments. À l’aide de cette plate-forme, les changements métaboliques en réponse au médicament peuvent être mesurés par spectroscopie Raman, tandis que le médicament et son métabolite peuvent être quantifiés à l’aide de la spectrométrie de masse dans la même cellule. Les résultats suggèrent qu’il est possible d’accéder à l’information sur l’utilisation des médicaments, le métabolisme et la réponse à un niveau unicellulaire.
Les cellules réagissent différemment aux changements de leur microenvironnement au niveau unicellulaire, un phénomène appelé hétérogénéité cellulaire1. Malgré cela, les études actuelles de découverte de médicaments sont basées sur des mesures moyennes des populations cellulaires, qui obscurcissent l’information sur les sous-populations potentielles ainsi que les variations unicellulaires2. Ces informations manquantes peuvent expliquer pourquoi certaines cellules sont plus sensibles aux médicaments tandis que d’autres sont résistantes. Fait intéressant, le manque d’information à cellule unique sur la réponse aux médicaments est une raison possible de l’échec des essais cliniques de phase II des médicaments3. Par conséquent, pour résoudre ce problème, les interactions cellulaires avec le médicament (c.-à-d. l’utilisation, le métabolisme et la réponse) doivent être mesurées au niveau d’une seule cellule.
Pour ce faire, nous avons conçu un système unique dans lequel les cellules individuelles vivantes sont examinées à l’aide de la spectroscopie Raman sans étiquette, puis encore caractérisée à l’aide de la spectrométrie de masse4. La spectroscopie raman fournit une empreinte moléculaire de l’état cellulaire, un spectre complexe résultant de la contribution de nombreuses molécules à l’intérieur de la cellule. Malgré cette complexité, on peut considérer que les empreintes digitales de Raman reflètent la structure et le métabolisme d’une cellule entière5,6. La spectroscopie raman excelle dans la mesure des états cellulaires d’une manière non invasive et relativement élevée, ce qui le rend utile pour le dépistage et l’évaluation de la réponse des médicaments au niveau unicellulaire.
En revanche, la SP fournit la sensibilité et la sélectivité requises pour mesurer l’apport médicamenteux au niveau unicellulaire. Étant donné que la SP est destructrice (l’échantillon [cellule] est généralement consommé au cours de l’analyse), son intégration à la spectroscopie Raman non destructive et sans étiquette peut fournir un débit élevé et un système sensible. Cette plate-forme combinée est capable de fournir plus d’informations sur l’apport de médicaments, le métabolisme et les effets au niveau unicellulaire.
Ce manuscrit élucide un protocole utilisé pour étudier les interactions cellulaires avec les médicaments au niveau unicellulaire à l’aide de cultures in vitro à l’aide d’une plate-forme Raman-MS intégrée. Pour ce faire, les cellules de carcinome hépatocellulaire (HepG2) et le tamoxifène sont utilisés comme modèle. Les cellules HepG2 ont été choisies parce qu’elles prennent le tamoxifène et métabolisent le médicament, et elles sont simultanément affectées en raison de ses effets hépatotoxiques. Deux états sont utilisés dans ce manuscrit : les cellules traitées par drogue par rapport aux cellules non traitées (contrôle).
Dans ce manuscrit, un cas simple a été choisi dans lequel les cellules HepG2 ont été exposées (ou non) au tamoxifène. La capacité d’un système de spectroscopie et de spectrométrie de masse de Raman est démontrée pour surveiller les effets du tamoxifène sur les cellules. La spectroscopie raman a permis d’identifier des biomarqueurs potentiels qui reflétaient une réponse générale des cellules individuelles à l’exposition aux médicaments. Une certaine hétérogénéité entre les cellules simples a été observée, suggérant que certaines cellules n’ont pas répondu à l’exposition de drogue. D’autre part, le LSC-MS était capable d’effectuer une analyse ciblée du médicament et de son métabolite au niveau unicellulaire, dans lequel un degré élevé d’hétérogénéité a été observé dans le médicament et son abondance de métabolites. Cette hétérogénéité aide à expliquer pourquoi certaines cellules sont affectées par le médicament alors que d’autres ne sont apparemment pas, malgré les cellules provenant d’une population soi-disant uniforme12.
Parmi les aspects particuliers de cette technique qui nécessitent une attention particulière, il est important d’évaluer la qualité de la configuration du microscope et le traitement du signal pour assurer la reproductibilité des données. Si le prétraitement des spectres est effectué avec soin, les variations du signal doivent être maximisées au maximum local de chaque pic. En revanche, la ligne de base et le bord des spectres devraient se chevaucher entre les conditions cellulaires testées. Un autre aspect important est le modèle multivarié utilisé pour étudier les différences entre les traitements. Il faut évaluer soigneusement les modèles et les paramètres du modèle pour assurer une analyse précise et précise. Un avantage du modèle PLS, contrairement aux réseaux neuronaux, est qu’il permet l’accès aux poids associés à chaque longueur d’onde (changements raman) qui distinguent le mieux les conditions testées par le modèle.
Malgré la spectroscopie Raman avec succès discriminant la réponse du médicament, il convient de souligner que cette technique est limitée dans son utilisation pour fournir une interprétation biologique. Cela est principalement dû à la complexité du signal spectral, qui englobe un mélange de milliers de molécules. Par conséquent, une étude plus approfondie est nécessaire pour évaluer les variations systématiques entre les intensités spectrales raman et les variations dans les concentrations de médicaments. En outre, des études similaires d’autres lignées cellulaires sont nécessaires pour évaluer la généralisation des biomarqueurs spectrals associés au tamoxifène.
En outre, il peut être intéressant d’effectuer des mesures des tissus vivants pour évaluer la pharmacodynamique et étudier comment les médicaments pénètrent et circulent dans chaque cellule. De plus, il convient de noter que l’étape d’échantillonnage de LSC-MS dépend fortement des compétences de l’exploitant. Les paramètres tels que la résolution spatiale, la position cellulaire à l’intérieur du capillaire après l’échantillonnage et la force de débit dépendent entièrement de l’opérateur, ce qui limite l’adoption à grande échelle du LSC-MS. Bien que, les systèmes d’échantillonnage automatisés peuvent atténuer ce problème. De plus, bien que le LSC-MS excelle dans l’échantillonnage des cellules adhérentes ou flottantes dans leurs États d’origine, il obtient de moins bons résultats dans les cellules d’échantillonnage intégrées dans les sections tissulaires. Cela est dû à la tendance de la pointe capillaire d’échantillonnage à se briser si la densité de l’échantillon est élevée. Par conséquent, une autre approche telle que la sonde unique peut être plus appropriée dans de tels cas14,15.
Étant donné que les cellules utilisées ici sont échantillonnées dans des conditions ambiantes avec une préparation minimale de l’échantillon, le LSC-MS peut être facilement intégré à d’autres technologies, comme le montre son intégration avec Raman dans ce protocole. Une autre intégration similaire avec l’holographie 3D a permis d’atteindre la quantitation absolue des métabolites cellulaires au niveau subcellulaire16. En outre, l’intégration avec la cytométrie de flux a permis la découverte de biomarqueurs métaboliques dans les cellules tumorales circulantes simples des patients atteints de cancer du neuroblastome17,18.
À l’avenir, en raison de l’intérêt croissant récent pour la combinaison des ensembles de données provenant des modalités d’imagerie19, il peut également être intéressant d’étudier les variations systématiques entre les signaux Raman et les résultats de spectrométrie de masse (ainsi que d’autres méthodes d’omics) en utilisant des approches de calcul intégratif. Fait intéressant, nous avons déjà trouvé plusieurs corrélations linéaires faibles mais significatives entre les intensités des pics Raman identifiés par les scores VIP et l’abondance de tamoxifène ou de son métabolite au niveau unicellulaire tel qu’identifié par MS4. Ces données peuvent suggérer une relation métabolique entre les profils de SP et les spectres Raman et la possibilité de prédire ces valeurs.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient Toshio Yanagida pour son soutien et les fonds de collaboration interne RIKEN attribués au Dr Arno Germond.
0.1% penicillin-streptomycin | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
35mm glass bottom grid dish | Matsunami | ||
4-Hydroxy Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 94873 | |
532 nm diode pumped solid-state laser | Ventus, Laser Quantum | ||
BIOS-L101T-S motorized microscope stage | OptoSigma | ||
CT-2 cellomics coated sampling capillaries | HUMANIX | ||
d5-Tamoxifen standard | Cambridge Isotope Laboratories | ||
Dimethyl sulfoxide LC-MS grade | Nacalai Tesque | D8418 | |
Dulbecco's Modified Eagle's medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Eppendorf GELoader tips | Eppendorf | ||
fetal bovine serum | Hyclone laboratories | SH3006603 | |
FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | ||
Formic acid LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 33015 | |
HepG2 cell line (RCB1886) | RIKEN cell bank center | RCB1886 | |
MC0-19A1C Incubator | Sanyo Electric Co. | MC0-19A1C | |
Methanol LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 1060352500 | |
MMO-203 3-D Micromanipulator | Narshige | MMO-203 | |
NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens | Olympus | ||
Nanoflex nano-ESI adaptor | Thermo Fisher Scientific | ES071 | |
On-stage incubator | ibidi | ||
Pierce LTQ Velos ESI calibration solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | |
PIXIS BR400 cooled CCD camera | Princeton Instruments | ||
Q-Exactive Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | ||
Rat-tail collagen coating solution | Cell Applications Inc. | ||
Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 85256 |