Uma plataforma integrada de espectroscopia e espectrometria de massa para estudar a absorção, metabolismo e efeitos de drogas unicelulares

1. Cultura celular Células de cultura de interesse em uma mídia cultural apropriada. Penicilina-estreptomicina pode ser adicionada para evitar a contaminação. No caso das células HepG2, as células culturais em uma mídia cultural contendo o meio modificado da Águia de Dulbecco (DMEM) complementada com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 0,1% penicilina-estreptomicina. Para faciltate Raman medições espectroscopia, as células podem ser cultivadas em um 0,1% de gelatina revestido prato de vidro-bottom ou slides de quartzo. Incubate células por 2 dias a 37 °C e 5% CO2 em uma incubadora umidificada. Sincronizar as culturas celulares para chegar a 70% de confluência. Células subculturais em um prato de grade de 35 mm com fundo de vidro ou lâminas de quartzo usando o mesmo meio em uma densidade de semeadura de 0,7 x 106, em seguida, incubar a 37 °C para 24 h.NOTA: Pratos ou slides de cultura podem ser pré-revestidos com solução de revestimento de colágeno ou gelatina com uma relação de superfície de cultura de 5 ug/cm2 para permitir que eles consertem, garantindo sua sobrevivência durante a medição. 2. Tratamento medicamentoso Retire as culturas celulares da incubadora e lave 2x com tampão PBS pré-aquecido (37 °C).NOTA: É ideal para remover as células para o tratamento de drogas em uma confluência de 50%-60%. Divida as células em subgrupos tratados e não tratados em pratos de cultura de 35 mm. Misture a droga de escolha com a mídia cultural. Por exemplo, dissolva o tamoxifeno no dimetil sulfoxida (DMSO) e misture-se com a mídia cultural para obter um volume final de 2 mL e concentração de tamoxifeno de 10 μM. Este será o grupo tratado com drogas. Misture um volume correspondente de solvente (DMSO) no meio como um controle para estudar os efeitos do DMSO. Este será o grupo de controle. Incubar ambos os grupos em 2 mL da mídia cravada preparado em etapas 2.3-2.4 para 24 h. A confluência esperada após a incubação deve ser de 70% a 80%. 3. Raman imagem espectral e processamento espectral NOTA: Embora os sistemas de espectroscopia Raman estejam disponíveis comercialmente, o sistema de espectroscopia Raman usado aqui é um microscópio confocal de varredura de linha construído em casa anteriormente descrito7,8. Resumidamente, este sistema está equipado com um laser de estado sólido bombeado de 532 nm. A luz laser é moldada em um plano usando uma lente cilíndrica, que permite a medição de 400 espectros em uma única exposição. Os espectros de Raman foram gravados usando uma câmera ccd resfriada montada em um policromador que usa uma grade de 1.200 sulcos/mm para maximizar a resolução espectral da região de impressão digital (de 500-1.800 cm-1). Esta área espectral contém uma alta densidade de frequências específicas para moléculas que gera dispersão de Raman. Uma lente de imersão na águaobjetiva (NA = 0,95) também é usada. A resolução espacial deste sistema é de ~300 nm e a resolução espectral é de 1 cma 1. Para garantir a sobrevivência celular durante o experimento, uma microcâmara fixada em um estágio de microscópio motorizado é usada. Antes das medições espectrais, verifique o alinhamento da ótica. Um pinhole de 50 μm pode ser usado para verificar se o pinhole e a posição do laser combinam exatamente. Digite a fenda espectrômetro quando estreitado, tanto quanto possível. Use etanol para calibrar o espectrômetro antes de cada experimento. Para fazer isso, coloque o EtOH em um prato com fundo de vidro, meça o espectro em uma determinada intensidade laser (medida na amostra) por 1 s, e associe o pico a comprimentos de onda conhecidos7. Minimize a intensidade do laser na amostra para ~2.4 mW/μm2 para que as células sobrevivam à exposição a laser. Configure a microcâmara a 5% de CO2 e 37 °C. Uma vez que o sistema do microscópio está pronto, remova pilhas da incubadora e lave imediatamente pilhas 2x com tampão aquecido de PBS (37 °C) a seguir adicione 2 mL de PBS aquecido (37 °C) ou DMEM para resuspender as pilhas.NOTAS: Tanto pbs e fluorobrite dmem baseado mídia são opções suficientes para raman espectroscopia medidas porque eles produzem um sinal de fundo mínimo. Adicione 10 μL de água na lente objetiva de imersão na água e coloque delicadamente o prato de célula com fundo de vidro no estágio do microscópio. Medir cada célula, concentrando a linha laser. Um tempo de exposição de 15 anos por célula é suficiente aqui para obter uma seção transversal de uma célula com um sinal claro de Raman. Um espelho de galvano permite a digitalização de uma célula ou um grupo de células dentro de várias dezenas de minutos.NOTAS: Maior resolução de imagens espectrais completas de células requer mais tempo e pode levar a danos fotográficos. Aqui, as células foram medidas usando uma exposição de linha única para obter uma seção transversal de cada célula. Esta abordagem é um bom trade-off para aumentar a produção e obter informações suficientes para discriminar as células, garantindo também a viabilidade celular, limitando photodamage. 4. Pré-processamento de dados espectrais e análises multivariadas NOTA: O pré-processamento é uma etapa necessária antes da análise adicional, a fim de remover variações técnicas indesejadas dentro dos dados espectrais. Devido à diversidade dos métodos e software, uma lista exaustiva não pode ser fornecida, e há muitas revisões úteis encontradas na literatura7,8. Nesta seção, descrevemos brevemente a abordagem usada para analisar e interpretar dados espectrais de Raman obtidos de células individuais vivas. Extrato e pré-processe imagens de Raman para remover possíveis interferências de raios cósmicos.NOTA: Eixo espectral de espectros obtidos durante diferentes dias/semanas/meses pode incluir algumas variações devido a pequenas variações técnicas durante a calibração usando etanol. Isso afetará fortemente as análises multivariadas subsequentes e comparações estatísticas. No caso de os experimentos serem realizados durante diferentes semanas/meses, pequenas variações ópticas são esperadas. Neste caso, os dados devem ser interpolados para corrigir eventuais mudanças espectrais dos dados em todos os experimentos. Interpolação usando spline cúbico é usado aqui. Após esta etapa, todo o eixo espectro deve ser alinhado. Uma escala de 500-1.800 cm-1 é considerada para a análise subseqüente. Extrair dados espectrais de células e fundo (ausência de células) de cada imagem usando um algoritmo caseiro. Subtraia o sinal de fundo do sinal da célula. Em seguida, calcula a média dos espectros dos pixels restantes, que devem corresponder a uma única célula. As seguintes etapas são executadas usando os espectros 2D das pilhas. Realize uma correção de linha de base usando o ModPoly9 ou qualquer outro algoritmo que ele estimou para caber suficientemente. Apare a gama espectral para 600-1.700 cm-1 para selecionar a região de impressão digital e garantir que não haja efeitos de borda indesejados sobre os espectros devido à má montagem polinomial. Realize uma etapa de normalização, como normalização vetorial (a intensidade em cada número de onda é dividida pela norma l2 global ou valor singular máximo de um espectro) para normalizar a intensidade espectral10,embora outras normalizações possam ser consideradas. Prepare um conjunto de dados com o rótulo apropriado para cada classe/condição.NOTA: Análises espectrais comparativas podem ser analisadas para explorar a natureza de possíveis diferenças entre a classe/condições celulares (por exemplo, subtraindo o espectro médio do grupo controle a outros grupos para identificar regiões de interesse [como potenciais biomarcadores]). Os cálculos de pontuações da ANOVA e da Fisher também podem ser realizados10. Para identificar células tratadas e não tratadas com base em características espectrais, análises multivariadas podem ser aplicadas. Os dados espectrais normalizados devem ser utilizados como conjunto de dados de formação, e um conjunto de dados desconhecido (sem rótulo) de um experimento de replicação deve ser usado como dados de teste, se possível.NOTA: A análise discriminante realizada em algum vetor de uma análise de componente principal (PCA-DA10),projeção em escores latentes seguidas de análise discriminante (PLS-DA) e máquinas vetoreiras de suporte (SVM)11 são modelos frequentemente usados no campo, e cada um apresenta diferentes considerações estatísticas. Consequentemente, o pré-processamento de dados deve ser realizado. Use o aprendizado de máquina que se adapte aos objetivos experimentais. Aqui, uma projeção sobre o modelo de estrutura latente (PLS) é construída usando a região de impressão digital espectral de Espectros raman (600-1.710 cm-1)11,12. Mean-center os dados, se necessário. Para a validação cruzada do modelo, diferentes técnicas podem ser aplicadas.NOTA: Aqui, uma validação cruzada cega veneziana com 10 divisões é aplicada. A complexidade do modelo (número de componentes ou variável latente) deve ser testada para que o melhor modelo minimize o erro quadrado de raiz média (RMSE) valor. Verificou-se que três vetores latentes (LVs) forneceram a melhor discriminação com o nosso conjunto de dados. Identifique quais picos espectrais de Raman contribuem para a discriminação das células (por exemplo, traçando a pontuação de importância variável na projeção [VIP] para cada número de onda raman ou a magnitude do coeficiente de regressão).NOTAS: A pontuação VIP de uma variável é calculada como uma soma ponderada das correlações quadradas entre os componentes PLS-DA e a variável original. Detalhes sobre PLS e algoritmo de pontuações VIP podem ser encontrados na literatura11,12. 5. Configuração de amostragem de células únicas e procedimentos Corrigir o sistema de amostragem celular no microscópio Raman, como mostrado na Figura 1. Conecte o micromanipulador 3D ao suporte capilar de vidro que é unido a uma seringa vazia para a amostra que suga aplicando a pressão negativa(figura 1). Defina o microscópio em um campo de ampliação alta (40x) para observar a ponta do capilar de vidro e certifique-se de que não está quebrado. Controle a posição do capilar de vidro usando o micromanipulador (x-, y-, z-machados). Certifique-se de que a ponta capilar é centrada no campo de visão, em seguida, mover o capilar no eixo z para dar folga para o prato de cultura mais tarde.NOTA: A microamostragem das células é realizada pelo capilar de vidro para células com diâmetros entre 10-15 μm. Recomenda-se um capilar com um tamanho de furo de ~5 μm. Se o tamanho do furo for muito pequeno, a ponta capilar será conectada pela célula e, se for muito grande, a sensibilidade das medições posteriores da EM pode ser comprometida. Coloque a placa de amostra / prato no palco do microscópio, ajustar a ampliação e foco, selecione a célula-alvo no prato grade, e movê-lo para o centro de vista. Em seguida, abaixe cuidadosamente o capilar de vidro usando micromanipulador (z-eixo) até que a ponta entre em foco.NOTA: Certifique-se de não mover o capilar no x- e y-eixos até que o capilar está em foco. observação microscópica, toque na célula única alvo com a ponta capilar, em seguida, comece a aplicar pressão negativa usando a seringa para prender a célula dentro da ponta capilar. Registre este procedimento tirando uma foto ou vídeo para verificar o momento e a localização sugada da célula com precisão, se necessário. Mova o capilar para cima no eixo z. Em seguida, retire o capilar do suporte capilar usando fórceps em preparação para a análise da EM. 6. Medições de espectrometria de massa Calibrar a precisão em massa do instrumento MS de acordo com as recomendações do fabricante. Após a calibração, certifique-se de que o erro de massa não é maior do que 3 ppm. Otimizar o instrumento em EM para parâmetros mais adequados para o anlito de interesse.NOTA: No caso da análise de tamoxifeno e 4-OHT, os parâmetros do instrumento são definidos para o seguinte: temperatura capilar de entrada: 400 °C, tensão spray: 1500 V, meta de controle de ganho automático (AGC): 5.00E+06, Nível de RF de lente S: 90%, faixa DE SIM: 347-397 m/z, sim tempo máximo de injeção: 200 ms, Sim resolução: 140.000 FWHM, MS/ MS gama: 50-400 m/z, MS/ MS AGC meta: 2.00E+05, MS / MS tempo máximo de injeção: 100 ms, MS / MS resolução: 17.500 FWHM, MS / MS janela de isolamento: 1 m /z, MS / MS energia de colisão normalizada (NCE): 35. Configure um método de aquisição automática com uma duração de 5 min para o modo SIM para alcançar a quantidade relativa, e outro método de EM/EM para identificação positiva da droga e seu metabólito. Os parâmetros do método de aquisição devem ser definidos para os valores otimizados mencionados na etapa 6.2. Prepare o solvente de ionização um capô de fumaça. A composição solvente depende do anályte de interesse. Aqui, o solvente orgânico utilizado consiste em 80% MeOH, 10% DMSO e 0,1% de ácido fórmico. Misture um padrão interno apropriado com o solvente orgânico antes das medições. Neste experimento, 5,31 nM de d5-tamoxifeno é usado como um padrão interno. Para evitar falsos positivos, assapirata os meios de comunicação em torno das células tratadas com a droga usando um capilar de tamanho furo de 1 μm com observação microscópica constante para evitar a amostragem de quaisquer partes celulares. Adicione 2 μL do solvente de ionização para a extremidade larga do capilar contendo a mídia usando uma pipeta anexada a pontas carregador. Em seguida, analise os meios de comunicação amostrados por EM, verifique se há presença do anályte de interesse (normalmente, não deve ser detectável). Adicione 2 μL o solvente de ionização ao capilar contendo a célula, conserte o capilar a um adaptador de nanoeletrospray (nano-ESI) conectado a um espectrômetro de massa adequado e inicie o método de aquisição automática. 7. Processamento e análise de dados de espectrometria de massa NOTA: Qualquer software adequado pode ser usado para realizar análise de dados. No entanto, se os pesquisadores desejam realizar a análise de dados usando um software que não é fornecido pelo fornecedor de EM, então os dados brutos devem ser convertidos do formato de fornecedor proprietário para um formato aberto ou como um arquivo de texto primeiro (que foi feito aqui). Normalize os dados dividindo a área de pico do analyte de interesse (s) por a do padrão interno a partir da mesma varredura de EM. Em seguida, o log transforma as proporções de pico para reduzir a distorção. Trace a intensidade normalizada da droga ou seu metabólito como uma caixa ou curva de densidade para visualizar a distribuição em células únicas. Aqui, o software estatístico R é usado, juntamente com o pacote ggplot2. Calcule a droga metabolizada em relação de drogas não metabolizadas dividindo a abundância do metabólito da droga pela molécula de pai não metabolizada em cada célula (ou seja, 4-OHT e tamoxifeno, respectivamente.NOTA: A correlação entre variações de picos específicos de interesse de Raman e as variações nos picos de EM da droga ou seus metabólitos pode ser estudada. Esta é uma adição à possível correlação entre a droga em si e seu metabólito em células únicas. Isso pode ser feito calculando o coeficiente de correlação Pearson usando um teste de duas caudas. Abordagens integrativas mais avançadas também devem ser consideradas.