Eine integrierte Raman-Spektroskopie- und Massenspektrometrie-Plattform zur Untersuchung der Aufnahme von Einzelzellen-Medikamenten, des Stoffwechsels und der Effekte

1. Zellkultur Kulturzellen, die an einem geeigneten Kulturmedium interessiert sind. Penicillin-Streptomycin kann hinzugefügt werden, um eine Kontamination zu vermeiden. Bei HepG2-Zellen werden Kulturzellen in einem Kulturmedium, das Das modifizierte Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco enthält, mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 0,1% Penicillin-Streptomycin ergänzt. Um Die Messungen der Raman-Spektroskopie zu fadenzieren, können Zellen auf einer gelatinebeschichteten Glasbodenschale oder Quarzdias angebaut werden. Inkubieren Sie Zellen für 2 Tage bei 37 °C und 5%CO2 in einem befeuchteten Inkubator. Synchronisieren Sie Zellkulturen, um 70% Konfluenz zu erreichen. Subkulturzellen in eine 35 mm Glasbodengitterschale oder Quarzschlitten mit dem gleichen Medium bei einer Sädichte von 0,7 x 106, dann bei 37 °C für 24 h inkubieren.HINWEIS: Kulturgerichte oder Dias können mit Kollagen- oder Gelatinebeschichtungslösung mit einem Kulturoberflächenverhältnis von 5 ug/cm2 vorbeschichtet werden, damit sie sich fixieren können, um ihr Überleben während der Messung zu gewährleisten. 2. Drogenbehandlung Zellkulturen aus dem Inkubator entfernen und 2x mit vorgewärmten PBS-Puffer (37 °C) waschen.HINWEIS: Es ist optimal, Zellen für die medikamentöse Behandlung bei einer Konfluenz von 50%-60% zu entfernen. Teilen Sie Zellen in medikamentös behandelte und unbehandelte Untergruppen in 35 mm Kulturgerichten auf. Mischen Sie die Droge der Wahl mit den Kulturmedien. Lösen Sie z. B. Tamoxifen in Dimethylsulfoxid (DMSO) und mischen Sie es mit den Kulturmedien, um eine Endvolumenmenge von 2 ml und eine Tamoxifenkonzentration von 10 m zu erhalten. Dies wird die drogenbehandelte Gruppe sein. Mischen Sie ein entsprechendes Volumen lösungsmittel (DMSO) in das Medium als Kontrolle, um die Auswirkungen von DMSO zu untersuchen. Dies wird die Kontrollgruppe sein. Inkubieren Sie beide Gruppen in 2 ml der spiked Medien in den Schritten 2.3-2.4 für 24 h vorbereitet. Die erwartete Konfluency nach der Inkubation sollte 70%-80% betragen. 3. Raman Spektrale Bildgebung und spektrale Verarbeitung HINWEIS: Obwohl Raman-Spektroskopiesysteme im Handel erhältlich sind, ist das hier verwendete Raman-Spektroskopiesystem ein selbstgebautes Konfokalmikroskop, das zuvor beschrieben wurde7,8. Kurz gesagt, ist dieses System mit einem 532 nm Diode gepumpt Enkstate-Laser ausgestattet. Das Laserlicht wird mit einer zylindrischen Linse zu einer Ebene geformt, die die Messung von 400 Spektren in einer einzigen Belichtung ermöglicht. Raman-Spektren wurden mit einer gekühlten CCD-Kamera aufgenommen, die auf einem Polychromator montiert ist, der ein 1.200 Nuten/mm Gitter verwendet, um die spektrale Auflösung des Fingerabdruckbereichs zu maximieren (von 500-1.800 cm-1). Dieser Spektralbereich enthält eine hohe Dichte von Frequenzen, die spezifisch für Moleküle sind, die Raman-Streuung erzeugen. Eine Wasser-Immersionobjektivlinse (NA = 0,95) wird ebenfalls verwendet. Die räumliche Auflösung dieses Systems beträgt 300 nm und die Spektralauflösung 1 cm-1. Um das Überleben der Zelle während des Experiments zu gewährleisten, wird eine Mikrokammer verwendet, die auf einer motorisierten Mikroskopstufe befestigt ist. Überprüfen Sie vor spektralen Messungen die Ausrichtung der Optik. Mit einem 50-mm-Loch kann überprüft werden, ob loch und laserposition genau übereinstimmen. Geben Sie den Spektralphotometer-Schlitz ein, wenn Sie so weit wie möglich verengt sind. Verwenden Sie Ethanol, um das Spektralphotometer vor jedem Experiment zu kalibrieren. Um dies zu tun, legen Sie EtOH in eine Glasbodenschale, messen Sie das Spektrum bei einer bestimmten Laserintensität (gemessen an der Probe) für 1 s und assoziieren Sie den Peak zu bekannten Wellenlängen7. Minimieren Sie die Laserintensität an der Probe auf 2,4mW/m2, damit die Zellen die Laserexposition überleben. Richten Sie die Mikrokammer bei 5%CO2 und 37 °C ein. Sobald das Mikroskopsystem fertig ist, entfernen Sie Zellen aus dem Inkubator und spülen Sie zellen sofort 2x mit erwärmtem PBS-Puffer (37 °C) aus, und fügen Sie dann 2 ml erwärmtes PBS (37 °C) oder DMEM hinzu, um die Zellen wieder aufzuhängen.HINWEISE: Sowohl PBS als auch FluoroBrite DMEM-basierte Medien sind ausreichend Optionen für Raman-Spektroskopie-Messungen, da sie ein minimales Hintergrundsignal erzeugen. Fügen Sie 10 l Wasser auf die Wasser-Immersion-Objektivlinse und legen Sie die Glasboden-Zellschale zart auf die Mikroskop-Bühne. Messen Sie jede Zelle, indem Sie die Laserlinie fokussieren. Eine Belichtungszeit von 15 s pro Zelle reicht hier aus, um einen Querschnitt einer Zelle mit einem klaren Raman-Signal zu erhalten. Ein Galvanospiegel ermöglicht das Scannen einer Zelle oder einer Gruppe von Zellen innerhalb von mehreren Dutzend Minuten.HINWEISE: Eine höhere Auflösung der vollständigen spektralen Bildgebung von Zellen erfordert mehr Zeit und kann zu Photoschäden führen. Hier wurden die Zellen mit einer einzeiligen Exposition gemessen, um einen Querschnitt jeder Zelle zu erhalten. Dieser Ansatz ist ein guter Kompromiss, um den Durchsatz zu erhöhen und ausreichende Informationen zu erhalten, um Zellen zu diskriminieren, während gleichzeitig die Zelllebensfähigkeit durch die Begrenzung von Photoschäden sichergestellt wird. 4. Vorverarbeitung von Spektraldaten und multivariaten Analysen HINWEIS: Die Vorverarbeitung ist ein notwendiger Schritt vor der zusätzlichen Analyse, um unerwünschte technische Abweichungen innerhalb der Spektraldaten zu entfernen. Aufgrund der Vielfalt der Methoden und Software kann keine erschöpfende Liste zur Verfügung gestellt werden, und es gibt viele hilfreiche Bewertungen in der Literaturgefunden 7,8. In diesem Abschnitt beschreiben wir kurz den Ansatz zur Analyse und Interpretation von spektralen Raman-Daten, die aus lebenden Einzelzellen gewonnen wurden. Extrahieren und vorverarbeiten Raman-Bilder, um mögliche kosmische Strahlungsstörungen zu entfernen.HINWEIS: Die Spektralachse von Spektren, die während verschiedener Tage/Wochen/Monate gewonnen werden, kann aufgrund kleiner technischer Schwankungen während der Kalibrierung mit Ethanol einige Abweichungen aufweisen. Dies wird sich stark auf die nachfolgenden multivariaten Analysen und statistischen Vergleiche auswirken. Für den Fall, dass Experimente in verschiedenen Wochen/Monaten durchgeführt werden, werden kleine optische Variationen erwartet. In diesem Fall müssen die Daten interpoliert werden, um eventuelle spektrale Verschiebungen der Daten über Experimente hinweg zu korrigieren. Hier wird die Interpolation mit kubischem Spline verwendet. Nach diesem Schritt sollte die gesamte Spektrenachse ausgerichtet werden. Für die nachfolgende Analyse wird ein Bereich von 500-1.800 cm-1 berücksichtigt. Extrahieren Sie Spektraldaten von Zellen und Hintergrund (Abwesenheit von Zellen) aus jedem Bild mit einem hausgemachten Algorithmus. Subtrahieren Sie das Hintergrundsignal vom Signal der Zelle. Dann durchschnittlich die Spektren der verbleibenden Pixel, die einer einzelnen Zelle entsprechen sollten. Die folgenden Schritte werden mit den 2D-Spektren der Zellen durchgeführt. Führen Sie eine Baseline-Korrektur mit modPoly9 oder einem anderen Algorithmus durch, der auf ausreichend gepasst hat. Schneiden Sie den Spektralbereich auf 600-1.700 cm-1 ab, um den Fingerabdruckbereich auszuwählen und sicherzustellen, dass es aufgrund der schlechten Polynomanpassung keine unerwünschten Kanteneffekte auf die Spektren gibt. Führen Sie einen Normalisierungsschritt wie vektornormalisierung (die Intensität bei jeder Wellenzahl wird durch die globale l2-Norm oder den maximalen Singularwert eines Spektrums geteilt), um die Spektralintensität10zu normalisieren, obwohl andere Normalisierungen in Betracht gezogen werden können. Bereiten Sie ein Dataset mit der entsprechenden Bezeichnung für jede Klasse/Bedingung vor.HINWEIS: Vergleichende Spektralanalysen können perforiert werden, um die Art möglicher Unterschiede zwischen Zellklassen/Bedingungen zu untersuchen (z. B. durch Subtraktion des durchschnittlichen Spektrums der Kontrollgruppe auf andere Gruppen, um Interessengebiete zu identifizieren [wie potenzielle Biomarker]). ANOVA- und Fisher-Scores-Berechnungen können auch10durchgeführt werden. Um behandelte und unbehandelte Zellen anhand von spektralen Merkmalen zu identifizieren, können multivariate Analysen angewendet werden. Normalisierte Spektraldaten sollten als Trainingsdatensatz und ein unbekanntes Dataset (ohne Beschriftung) aus einem Replikationsexperiment nach Möglichkeit als Testdaten verwendet werden.ANMERKUNG: Discriminant-Analysen, die an einem Vektor einer Hauptkomponentenanalyse (PCA-DA10) durchgeführt werden, projektionen latente Werte, gefolgt von Diskriminanzanalyse (PLS-DA) und Support Vector Machines (SVM)11 sind Modelle, die häufig im Feld verwendet werden, und stellen jeweils unterschiedliche statistische Überlegungen dar. Die Vorverarbeitung der Daten sollte konsequent erfolgen. Verwenden Sie maschinelles Lernen, das den experimentellen Zielen entspricht. Hier wird eine Projektion auf latente Struktur (PLS) Modell mit dem spektralen Fingerabdruckbereich von Raman Spektren (600-1,710 cm-1)11,12gebaut. Mittleren Zentrieren Sie die Daten nach Bedarf. Für die Kreuzvalidierung des Modells können verschiedene Techniken angewendet werden.HINWEIS: Hier wird eine venezianische Blind-Cross-Validierung mit 10 Splits angewendet. Die Modellkomplexität (Anzahl der Komponenten oder latente Variable) sollte getestet werden, damit das beste Modell den RMSE-Wert (Root Mean Square Error) minimiert. Es wurde festgestellt, dass drei latente Vektoren (LVs) die beste Diskriminierung mit unserem Datensatz darstellten. Identifizieren Sie, welche Raman-Spektralspitzen zur Diskriminierung der Zellen beitragen (z. B. durch Plotten der Punktzahl von variabler Bedeutung in der Projektion [VIP] für jede Raman-Wellenzahl oder die Größe des Regressionskoeffizienten).HINWEISE: Der VIP-Score einer Variablen wird als gewichtete Summe der quadrierten Korrelationen zwischen den PLS-DA-Komponenten und der ursprünglichen Variablen berechnet. Details zum PLS- und VIP-Scores-Algorithmus finden Sie in der Literatur11,12. 5. Einrichtung von Einzelzellenproben und Verfahren Fixieren Sie das Zellentnahmesystem auf dem Raman-Mikroskop, wie in Abbildung 1dargestellt. Schließen Sie den 3D-Mikromanipulator an den Glaskapillarhalter an, der an einer leeren Spritze zum Probensaugen befestigt ist, indem Sie Unterdruck anwenden (Abbildung 1). Stellen Sie das Mikroskop auf ein hoch vergrößertes Feld (40x) ein, um die Spitze der Glaskapillare zu beobachten und sicherzustellen, dass es nicht gebrochen ist. Steuern Sie die Position der Glaskapillare mit dem Mikromanipulator (x-, y-, z-Achsen). Stellen Sie sicher, dass die Kapillarspitze im Sichtfeld zentriert ist, und bewegen Sie dann die Kapillare auf der Z-Achse nach oben, um später Freiraum für die Kulturschale zu geben.ANMERKUNG: Die Mikroprobe der Zellen erfolgt durch die Glaskapillare für Zellen mit Durchmessern zwischen 10 und 15 m. Es wird eine Kapillare mit einer Bohrungsgröße von 5 m empfohlen. Wenn die Bohrungsgröße zu klein ist, wird die Kapillarspitze von der Zelle gesteckt, und wenn sie zu groß ist, kann die Empfindlichkeit späterer MS-Messungen beeinträchtigt werden. Legen Sie die Probenplatte/Schale auf die Bühne des Mikroskops, passen Sie die Vergrößerung und den Fokus an, wählen Sie die Zielzelle auf der Gitterschale aus und verschieben Sie sie in die Mitte der Ansicht. Dann die Glaskapillare vorsichtig mit Mikromanipulator (Z-Achse) nach unten senken, bis die Spitze in den Fokus rückt.HINWEIS: Achten Sie darauf, die Kapillare in den x- und y-Achsen nicht zu bewegen, bis die Kapillare im Fokus steht. Berühren Sie unter mikroskopischer Beobachtung die Ziel-Einzelzelle mit der Kapillarspitze, und setzen Sie dann mit der Spritze unter Druck, um die Zelle in der Kapillarspitze einzufangen. Zeichnen Sie dieses Verfahren auf, indem Sie ein Foto oder Video aufnehmen, um das Timing und die gesaugte Position der Zelle bei Bedarf genau zu überprüfen. Bewegen Sie die Kapillare auf der Z-Achse nach oben. Lösen Sie dann die Kapillare mit Zangen aus dem Kapillarhalter, um die MS-Analyse vorzubereiten. 6. Massenspektrometriemessungen Kalibrieren Sie die Massengenauigkeit des MS-Instruments gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Stellen Sie nach der Kalibrierung sicher, dass der Massenfehler nicht größer als 3 ppm ist. Optimieren Sie das MS-Instrument auf Parameter, die für den anfallenden Analyten am besten geeignet sind.HINWEIS: Bei Tamoxifen- und 4-OHT-Analysen werden die Geräteparameter wie folgt eingestellt: Einlasskapillartemperatur: 400 °C, Sprühspannung: 1500 V, automatischeverstärkungskontrollziel (AGC): 5.00E+06, S-Objektiv-HF-Pegel: 90%, SIM-Bereich: 347-397 m/z, SIM maximale Einspritzzeit: 200 ms, SIM-Auflösung: 140.000 FWHM, MS/MS-Bereich: 50-400 m/z, MS/MS AGC-Ziel: 2,00E+05, MS/MS maximale Einspritzzeit: 100 ms, MS/MS-Auflösung: 17.500 FWHM, MS/MS-Isolationsfenster: 1 m/z, MS/MS normalisierte Kollisionsenergie (NCE): 35. Richten Sie eine automatische Erfassungsmethode mit einer Dauer von 5 minuten für den SIM-Modus ein, um eine relative Quantifizierung zu erreichen, und eine weitere MS/MS-Methode zur positiven Identifizierung des Arzneimittels und seines Metaboliten. Die Parameter der Erfassungsmethode sollten auf die in Schritt 6.2 genannten optimierten Werte gesetzt werden. Bereiten Sie das Ionisationslösungsmittel unter einer Dunstabzugshaube vor. Die Lösungsmittelzusammensetzung hängt vom Analyten des Interesses ab. Hier bei diesem Gehalt besteht das verwendete organische Lösungsmittel aus 80% MeOH, 10% DMSO und 0,1% Ameisensäure. Mischen Sie vor den Messungen einen geeigneten internen Standard mit dem organischen Lösungsmittel. In diesem Experiment wird 5,31 nM d5-Tamoxifen als interner Standard verwendet. Um Fehlalarme zu vermeiden, aspirieren Sie die Medien, die die mit dem Medikament behandelten Zellen umgeben, mit einer 1 m Bohrerkapillare mit konstanter mikroskopischer Beobachtung, um eine Probenahme von Zellteilen zu vermeiden. Fügen Sie 2 L des Ionisationslösungsmittels an das breite Ende der Kapillare, die das Medium enthält, mit einer Pipette, die an Laderspitzen befestigt ist. Analysieren Sie dann die abgetasteten Medien nach MS, überprüfen Sie, ob der Analyt von Interesse ist (normalerweise sollte es nicht nachweisbar sein). Fügen Sie 2 L das Ionisationslösungsmittel in die Kapillare, die die Zelle enthält, an einen Nanoelektrospray-Adapter (Nano-ESI) zu befestigen, der mit einem geeigneten Massenspektrometer verbunden ist, und starten Sie die automatische Erfassungsmethode. 7. Massenspektrometrie Datenverarbeitung und -analyse HINWEIS: Jede geeignete Software kann für die Datenanalyse verwendet werden. Wenn Forscher jedoch Datenanalysen mit einer Software durchführen möchten, die nicht vom MS-Anbieter bereitgestellt wird, sollten die Rohdaten vom proprietären Herstellerformat in ein offenes Format oder als Textdatei zuerst konvertiert werden (was hier geschehen ist). Normalisieren Sie die Daten, indem Sie den Spitzenbereich des Analyten von Interesse(en) durch den des internen Standards aus demselben MS-Scan dividieren. Anschließend transformieren Sie die Spitzenverhältnisse, um die Schiefe zu reduzieren. Zeichnen Sie die normalisierte Intensität des Arzneimittels oder seines Metaboliten als Boxplot oder Dichtekurve, um die Verteilung über einzelne Zellen zu visualisieren. Hier wird r.statistische Software verwendet, zusammen mit dem paket ggplot2. Berechnen Sie das metabolisierte Medikament zu unmetabolisierten Wirkstoffverhältnis, indem Sie die Häufigkeit des Arzneimittelmetaboliten durch die des nicht metabolisierten Elternmoleküls in jeder Zelle (d. h. 4-OHT bzw. Tamoxifen) dividieren.ANMERKUNG: Die Korrelation zwischen Variationen spezifischer Raman-Spitzen und den Variationen der MS-Spitzen des Arzneimittels oder seiner Metaboliten kann untersucht werden. Dies ist eine Ergänzung zur möglichen Korrelation zwischen dem Medikament selbst und seinem Metaboliten in einzelnen Zellen. Dies kann durch Berechnung des Pearson-Korrelationskoeffizienten mit einem zweischwänzigen Test erfolgen. Auch fortgeschrittenere integrative Ansätze sollten in Betracht gezogen werden.