Bu protokol, tek hücreli çözünürlüğe ulaşabilen entegre bir Raman spektroskopi-kütle spektrometresi (MS) platformu sunar. Raman spektroskopisi ilaçlara hücresel yanıt çalışma için kullanılabilir, MS ilaç alımı ve metabolizma hedefli ve kantitatif analizi için kullanılabilir iken.
Hücreler ilaçlara verdikleri yanıtlarda doğal olarak heterojen olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, tek hücreli heterojenitenin ilaç keşif çalışmalarında hesaba katEdilmesi esastır. Bu doğru tek hücre düzeyinde bir hücre ve ilaç arasındaki hücresel etkileşimlerin bolluk ölçme ile elde edilebilir (yani, ilaç alımı, metabolizma, ve etkisi). Bu makalede, ilaçlara yanıt olarak hücrelerin metabolik değişikliklerini izlemek için tek hücreli Raman spektroskopisi ve kütle spektrometresi (MS) platformu açıklanmaktadır. Bu platformu kullanarak, ilaca yanıt metabolik değişiklikler Raman spektroskopisi ile ölçülebilir, ilaç ve metaboliti aynı hücrede kütle spektrometresi kullanılarak ölçülebilir. Sonuçlar, tek hücreli düzeyde ilaç alımı, metabolizma ve yanıt hakkında bilgilere erişimin mümkün olduğunu göstermektedir.
Hücreler mikro ortamlarındaki değişimlere tek hücredüzeyinde farklı tepki verirler, bu fenomen hücresel heterojenlik1olarak adlandırılır. Buna rağmen, mevcut uyuşturucu keşif çalışmaları hücre popülasyonlarının ortalama ölçümleri dayanmaktadır, hangi potansiyel alt popülasyonlar hakkında bilgi gizlemek yanı sıra tek hücrevaryasyonları2. Bu eksik bilgiler bazı hücrelerin ilaçlara neden daha duyarlı olduğunu açıklayabilirken, diğerleri dirençlidir. İlginçtir, ilaç yanıtı hakkında tek hücreli bilgi eksikliği ilaçların faz II klinik çalışmaların başarısızlığı için olası bir nedenidir3. Bu nedenle, bu sorunu gidermek için, ilaç ile hücresel etkileşimleri (yani, alım, metabolizma, ve yanıt) tek hücre düzeyinde ölçülmelidir.
Bunu başarmak için, içinde yaşayan tek hücrelerin etiketsiz Raman spektroskopisi kullanılarak tarandır benzersiz bir sistem tasarladık sonra daha fazla kütle spektrometresi kullanılarak karakterize4. Raman spektroskopisi hücresel devletin moleküler parmak izi sağlar, hücre içinde birçok molekülün katkıları sonucu karmaşık bir spektrum. Bu karmaşıklığa rağmen, Raman parmak izleri bütün bir hücrenin yapısı ve metabolizma 5 yansıttığı düşünülebilir5,6. Raman spektroskopisi, hücresel durumları noninvaziv ve nispeten yüksek bir şekilde ölçmede öne çıkmaktadır, bu da ilaç yanıtınıtek hücreli düzeyde taranması ve değerlendirilmesi için yararlıdır.
Buna karşılık, MS tek hücredüzeyinde ilaç alımını ölçmek için gerekli duyarlılık ve seçicilik sağlar. MS yıkıcı olduğundan (örnek [hücre] genellikle analiz sırasında tüketilir), zararsız, etiketsiz Raman spektroskopisi ile entegre yüksek iş ve hassas bir sistem sağlayabilir. Bu kombine platform ilaç alımı hakkında daha fazla bilgi sağlama yeteneğine sahiptir, metabolizma, ve etkileri tek hücredüzeyinde.
Bu el yazması entegre raman-MS platformu kullanarak in vitro kültürleri kullanarak tek hücre düzeyinde ilaçlarile hücresel etkileşimleri incelemek için kullanılan bir protokol açıklanır. Bunun için hepatosellüler karsinom hücreleri (HepG2) ve tamoksifen model olarak kullanılmaktadır. HepG2 hücreleri tamoksifen almak ve ilaç metabolize çünkü seçildi, ve aynı anda hepatotoksik etkileri nedeniyle etkilenir. Bu el yazmasında iki durum kullanılmaktadır: uyuşturucu ile tedavi edilen hücreler vs. tedavi edilmeyen hücreler (kontrol).
Bu yazıda, HepG2 hücrelerinin tamoksifene maruz kaldığı (ya da maruz kalmadığı) basit bir olgu seçilmiştir. Raman spektroskopisi ve kütle spektrometresi sisteminin yeteneği tamoksifenin hücreler üzerindeki etkilerini izlemek için gösterilmiştir. Raman spektroskopisi, tek hücrenin uyuşturucuya maruz kalma genel yanıtını yansıtan potansiyel biyobelirteçlerin tanımlanmasına olanak sağladı. Tek hücreler arasında bazı heterojenlik gözlenmiştir, bu da bazı hücrelerin uyuşturucuya maruz kalma larına yanıt vermediğini düşündürmektedir. Öte yandan, LSC-MS tek hücre düzeyinde ilaç ve metaboliti hedefli bir analiz yapma yeteneğine sahip oldu, hangi heterojenite yüksek derecede ilaç ve metabolit bolluğu gözlendi. Bu heterojenlik bazı hücrelerin ilaç tan etkilendiğini açıklamaya yardımcı olurken, diğerleri görünüşte değil, sözde tek tip popülasyondan kaynaklanan hücrelere rağmen12.
Bu tekniğin dikkat gerektiren belirli yönleri arasında, verilerin tekrarlanabilirliğini sağlamak için mikroskop kurulumu ve sinyal işleme kalitesinin değerlendirilmesi önemlidir. Spektrumun ön işlemesi dikkatle yapılırsa, sinyal varyasyonları her tepenin yerel maksimum unda en üst düzeye çıkarılmalıdır. Buna karşılık, spektrumun taban çizgisi ve kenarı test edilen hücre koşulları arasında çakışmalıdır. Bir diğer önemli yönü tedaviler arasındaki farklılıkları araştırmak için kullanılan çok değişkenli modeldir. Bir dikkatle modelleri ve model parametreleri hassas ve doğru bir analiz sağlamak için değerlendirmek gerekir. PLS modelinin bir avantajı, sinir ağları aksine, her dalga boyu ile ilişkili ağırlıkları erişim sağlar (Raman vardiya) en iyi modeli tarafından test koşulları ayırt.
Raman spektroskopisi başarıyla ilaç yanıtı ayrımcılık rağmen, bu tekniğin biyolojik yorumu sağlamak için kullanımı sınırlı olduğu vurgulanmalıdır. Bunun başlıca nedeni binlerce molekülün karışımını kapsayan spektral sinyalin karmaşıklığıdır. Bu nedenle, Raman spektral yoğunlukları ve ilaç konsantrasyonları arasındaki sistematik varyasyonları değerlendirmek için daha fazla araştırma gereklidir. Ayrıca, diğer hücre hatları benzer çalışmalar tamoksifen ile ilişkili spektral biyobelirteçlerin genellemesi değerlendirmek için gereklidir.
Ayrıca, farmakodinamik değerlendirmek ve ilaçların her hücre içinde nüfuz ve akışı nasıl çalışma canlı doku ölçümleri yapmak ilgi olabilir. Ayrıca, LSC-MS’deki örnekleme adımının operatörün becerisine son derece bağlı olduğu unutulmamalıdır. Uzamsal çözünürlük, örnekleme den sonra kılcal damar içindeki hücre konumu ve iş gücü gibi parametreler tamamen işleç bağlıdır ve bu da LSC-MS’in büyük ölçekli benimsenmesini sınırlar. Ancak, otomatik örnekleme sistemleri bu sorunu hafifletmek olabilir. Ayrıca, LSC-MS kendi yerel durumlarında yapışık veya yüzen hücreleri örneklemede öne çıkan, doku bölümlerine gömülü örnekleme hücrelerinde daha kötü performans gösterir. Bunun nedeni, numune yoğunluğu yüksekse, numune kılcal ucunun kırılma eğilimidir. Bu nedenle, tek sonda gibi başka bir yaklaşım gibi bu gibi durumlarda daha uygun olabilir14,15.
Burada kullanılan hücreler en az örneklem hazırlığı ile ortam koşullarında örneklendirilebildiği için, LSC-MS bu protokolde Raman ile entegrasyonu ile gösterildiği gibi, diğer teknolojilerle kolayca entegre edilebilir. 3D holografi ile benzer bir entegrasyon hücre altı düzey16hücresel metabolitlerin mutlak nicelik elde etmek için izin verdi. Ayrıca, akış sitometri ile entegrasyon nöroblastom kanser hastalarının tek dolaşan tümör hücrelerinde metabolik biyobelirteçlerin ortaya çıkarılması için izin verdi17,18.
Gelecekte, görüntüleme yöntemleri19veri kümeleri birleştirerek son artan ilgi nedeniyle, aynı zamanda raman sinyalleri ve kütle spektrometresi sonuçları arasındaki sistematik varyasyonları incelemek için ilgi olabilir (yanı sıra diğer omics yöntemleri) entegre hesaplamalı yaklaşımlar kullanarak. İlginçtir, biz zaten VIP puanları ve tamoksifen veya ms4tarafından tanımlanan tek hücreli düzeyde metabolitbolü ile tanımlanan Raman zirvelerinin yoğunlukları arasında birkaç zayıf ama önemli doğrusal korelasyon bulduk . Bu veriler, MS profilleri ile Raman spektrumları arasında metabolik bir ilişki ve bu değerleri tahmin etme olasılığı önerebilir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar toshio Yanagida’ya desteği ve Dr. Arno Germond’a atfedilen RIKEN iç işbirlikçi fonları için teşekkür eder.
0.1% penicillin-streptomycin | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
35mm glass bottom grid dish | Matsunami | ||
4-Hydroxy Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 94873 | |
532 nm diode pumped solid-state laser | Ventus, Laser Quantum | ||
BIOS-L101T-S motorized microscope stage | OptoSigma | ||
CT-2 cellomics coated sampling capillaries | HUMANIX | ||
d5-Tamoxifen standard | Cambridge Isotope Laboratories | ||
Dimethyl sulfoxide LC-MS grade | Nacalai Tesque | D8418 | |
Dulbecco's Modified Eagle's medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Eppendorf GELoader tips | Eppendorf | ||
fetal bovine serum | Hyclone laboratories | SH3006603 | |
FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | ||
Formic acid LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 33015 | |
HepG2 cell line (RCB1886) | RIKEN cell bank center | RCB1886 | |
MC0-19A1C Incubator | Sanyo Electric Co. | MC0-19A1C | |
Methanol LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 1060352500 | |
MMO-203 3-D Micromanipulator | Narshige | MMO-203 | |
NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens | Olympus | ||
Nanoflex nano-ESI adaptor | Thermo Fisher Scientific | ES071 | |
On-stage incubator | ibidi | ||
Pierce LTQ Velos ESI calibration solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | |
PIXIS BR400 cooled CCD camera | Princeton Instruments | ||
Q-Exactive Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | ||
Rat-tail collagen coating solution | Cell Applications Inc. | ||
Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 85256 |