Delineamos un protocolo de 9 días para la transducción y expansión de células mononucleares de sangre periférica de rhesus macaque que produce células con excelente coexpresión de los genes de interés en número suficiente para estudios de infusión de eficacia celular.
Las inmunoterapias emergentes para tratar enfermedades infecciosas y cánceres a menudo implican la transducción de poblaciones celulares con genes que codifican proteínas dirigidas a enfermedades. Por ejemplo, las células T del receptor de antígeno quimérico (CAR)-T para tratar los cánceres y las infecciones virales implican la transducción de las células T con genes sintéticos que codifican moléculas CAR. Las moléculas CAR hacen que las células T reconozcan y maten específicamente el cáncer o las células infectadas viralmente. Las células también pueden ser co-transducidas con otros genes de interés. Por ejemplo, las células pueden ser co-transducidas con genes que codifican proteínas que dirigen las células a ubicaciones específicas. Aquí, presentamos un protocolo para transducir células mononucleares de sangre periférica primaria (PPBCM) con genes que codifican un CAR específico del virus y la molécula de folículo de células B que homing tipo 5 (CXCR5). Este procedimiento toma nueve días y da como resultado poblaciones transducidas de células T que mantienen un fenotipo de memoria central. Se ha demostrado que el mantenimiento de una memoria central o un fenotipo menos diferenciado se asocia con la persistencia de las células después de la infusión. Además, las células producidas con este método muestran altos niveles de viabilidad, altos niveles de co-expresión de los dos genes transducidos, y cantidades lo suficientemente grandes de células para la infusión inmunoterapéutica. Este protocolo de nueve días se puede utilizar ampliamente para los enfoques de inmunoterapia de células CAR-T y otros sellos. Los métodos descritos aquí se basan en estudios presentados en nuestras publicaciones anteriores.
Las inmunoterapias celulares están emergiendo como un nuevo medio para tratar enfermedades como cánceres y enfermedades infecciosas. Estos métodos de inmunoterapia a menudo implican manipular genéticamente las células terapéuticas para expresar moléculas específicas. Por ejemplo, las células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) están diseñadas para expresar una molécula CAR que tiene un dominio extracelular que une específicamente moléculas en células enfermas y un dominio de señalización que activa las células inmunitarias para matar a la célula enferma. Las células T CAR se utilizan con éxito en inmunoterapias contra el cáncer, y han sido particularmente eficaces en el tratamiento de las leucemias de células B1,2,3. Las células CAR-T también se están desarrollando para tratar infecciones virales como el VIH. Los CAR específicos del VIH se dirigen a las proteínas de envoltura en la superficie de las células infectadas viralmente4. Las células inmunoterapéuticas también se pueden diseñar para expresar moléculas de localización para dirigir las células terapéuticas a lugares de tejido específicos. Hemos desarrollado vectores que transducen tanto un CAR específico del virus como la molécula de afectación del folículo linfoide CXCR55.
La replicación viral de algunos virus, incluido el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y el virus de inmunodeficiencia simio (SIV), se concentra dentro de los folículos de células B en los tejidos linfoides secundarios6. Los folículos de células B son sitios algo privilegiados inmunes en los que niveles bajos de CTL específicos del virus permiten la replicación viral en curso7,8. Por estas razones, apuntar a células T específicas del VIH/SIV en el folículo a través de la expresión de CXCR5 es una estrategia para la eliminación del reservorio folicular de células infectadas viralmente9,10. Específicamente, estamos apuntando a células T CAR específicas de SIV a los folículos celulares B a través de la coexpresión CXCR5.
En este protocolo describimos un método para transducir CAR/CXCR5 y ampliar los PPM para producir células T CAR/CXCR5 de cantidades suficientes para la infusión terapéutica. Las células transducidas con estos métodos mantienen un fenotipo de memoria central. Los estudios han demostrado que las células con un fenotipo menos diferenciado, como las células T de memoria central y las células madre de memoria T, persisten mejor que las células más diferenciadas11,12. Además, muchos protocolos diseñados para producir células transferidas de forma adoptiva tienen tiempos de cultivo relativamente largos que dan como resultado células que tienen un fenotipo más diferenciado y una persistencia reducida13. Además, las células transferidas de forma adoptiva con largos tiempos de cultivo se acumulan dentro de los pulmones en lugar de tejidos linfoides diana en el macaco14,,15. En los métodos que describimos y demostramos aquí, transducimos y expandimos rápidamente los PMAC de macaco rhesus para producir células T transducidas que mantienen un fenotipo de memoria central.
Los glóbulos T CD4 y CD8 están incluidos en nuestro enfoque de inmunoterapia. Esta población de células mixtas se eligió porque, en los ensayos clínicos, la ausencia de células T CD4+ en el producto de células T CD8+ se correlacionó con un fallo de células T CD8 infundidas para persistir 16. Los métodos descritos aquí comienzan activando los PPM con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 que estimulan poderosamente el receptor de células T y proporcionan una señal coestimulante para evitar la anergy aclono17,18.
Después de la activación, las células son transducidas con un vector gammarretroviral que codifica un CAR específico del virus y la molécula de afectación linfoide CXCR5. Las células transducidas se expanden utilizando placas diseñadas para la propagación celular no adherente que tienen una membrana permeable al gas en la base. Esta membrana permite el intercambio de gas en la parte inferior del pozo que conduce a una mayor supervivencia celular y la disponibilidad de nutrientes19. Usando estos métodos, se pueden producir suficientes células funcionales en un período de tiempo de 9 días para estudios de infusión in vivo. Si bien este protocolo está diseñado para transducir y expandir las células T de rhesus macaco, con ligera modificación de los anticuerpos de activación específicos de la especie, se puede utilizar con células de otras especies. Estos métodos se basan en nuestros estudios publicados anteriormente9,20.
Este protocolo describe una estrategia de producción de inmunoterapia de células T que utiliza un vector gammarretroviral para transducir pBMC macaco rhesus que conduce a la población de células T que expresa una CAR antiviral, así como el receptor de localización folicular, CXCR5. Con un total de 8 días de tiempo de cultivo ex vivo, las células T CAR viables y funcionales se producen en una cantidad que se encuentra dentro del rango publicado10,21,22 utilizado para la perfusión en primates no humanos para pruebas de eficacia preclínica.
El éxito del protocolo de transducción se basa tanto en pMCO sano y estimulado como en preparaciones de calidad del gammaretrovirus. Con el fin de lograr una estimulación y transducción exitosas, es esencial que se tenga el cuidado adecuado en la congelación y el transporte de los PMNC después de la recolección. Idealmente, si las células se recogen fuera del sitio, se envían en nitrógeno líquido y se colocan rápidamente en el almacenamiento de nitrógeno líquido a largo plazo. Los PbMC deben ser mitotéticamente activos para poder ser transducidos con éxito por un gammaretrovirus. Uno debe monitorear visualmente para la agrupación de las células después de la estimulación con anti-CD3/anti-CD28. Si no se activa correctamente, se producirá una baja eficiencia de transducción. También es importante controlar la viabilidad en las células estimuladas. La mala viabilidad después del paso de estimulación generalmente conduce a una transducción menos exitosa. Ya sea que las preparaciones de virus se produzcan en el laboratorio o se externalicen, deben almacenarse a -80 oC en alícuotas de un solo uso para evitar ciclos de congelación del deshielo que pueden dañar el virus y afectar la eficiencia de la transducción. El virus debe ser titered para que cantidades consistentes de virus se pueden utilizar en cada experimento. Cuando utilice el virus para la transducción, descongelar el virus rápidamente y almacenar en hielo hasta que sea necesario. La elección de las proteínas promotoras, potenciadoras y envolventes puede afectar la eficiencia de transducción y la expresión del transgén en las células diana. Por lo tanto, un MOI debe ser empíricamente determinado. Además, el uso de un medio diseñado para soportar células T y placas con pozos permeables a gas para la expansión han llevado a una excelente expansión de las células transducidas. Sin embargo, hay variabilidad de animal a animal en la tasa de expansión celular. Recomendamos un estudio de ensayo para determinar la capacidad de una preparación celular en particular para ser transducido y ampliado. Los niveles de expansión son consistentes en transducciones a pequeña y gran escala.
Con el uso de este protocolo, hemos producido hasta 2,5 x 109 células para perfusión en animales de prueba. Aunque hemos encontrado innecesario escalar el protocolo en este momento, el uso de 6 placas de pozo es una limitación a la preparación de células a gran escala y el protocolo requeriría la modificación para producir un mayor número de células. Algunos ejemplos de posibles modificaciones son la realización de la transducción en una bolsa de cultivo recubierta de fibronectina para aumentar el número de células transducidas y utilizar un recipiente de cultivo permeable a gas más grande para el paso de expansión. Aunque todavía no hemos realizado estas alteraciones, utilizan productos disponibles comercialmente y son modificaciones factibles al protocolo actual.
Utilizando este método, hemos producido células transducidas a partir de PBMC aisladas de animales no infectados, animales infectados por el SIV y de animales infectados por el SIV tratados con terapia antirretroviral (TAR). Sin embargo, hemos observado una reducción en la eficiencia de la transducción en las células tratadas con TAR20. Esta reducción se debe presumiblemente a la inhibición de la transcriptasa inversa y/o la integración por parte de los fármacos. Las transducciones de células de animales tratados con TAR requerirán modificaciones a este protocolo, tales como la reducción de los niveles intracelulares de los fármacos ART mediante la interrupción del TAR durante varios días antes de recoger el PBMC o mediante el uso de un vector alternativo que no se ve afectado por los fármacos ART comúnmente en uso.
Es importante que las células producidas para la inmunoterapia sean de un fenotipo mínimamente diferenciado para que persistan después de la perfusión12. Aunque muchos protocolos para la transferencia adoptiva de células requieren largos tiempos de cultivo, un tiempo de cultivo ex vivo reducido se ha correlacionado con una reducción en la diferenciación y una mejora en la función de células T CAR13. El plazo relativamente rápido de este protocolo de transducción y expansión permite el mantenimiento del fenotipo de memoria central deseado mientras sigue produciendo células suficientes para probar su potencial inmunoterapéutico20.
El objetivo de la estrategia de producción de este producto de inmunoterapia de células T es fabricar células T que reconozcan las células infectadas por el SIV, se trafiquen al sitio de replicación viral en el folículo celular B y persistirán en el animal dando como resultado un cura funcional sin necesidad de medicamentos antirretrovirales. Para la traducción a un producto de inmunoterapia humana, este protocolo puede modificarse para transducir las células T humanas mediante el uso de anticuerpos y citoquinas específicos para el ser humano y la implementación de normas GMP con el objetivo final de producir una cura funcional para Vih.
The authors have nothing to disclose.
Este estudio fue apoyado por las subvenciones DE NIH 5R01AI0969666-06S1 (PS, EC y EB), 1UM1AI26617 (PS, CE y EB), P51OD011106/P51RR000167 (ER), MN REACH grant 5U01HL127479-03 (PS), 1R01A143380-01 (PS y EB), 1UM14126617 (PS y EC), así como fondos proporcionados por la División de Investigación Intramuros NIAID y el Programa Antiviral Dirigido al SIDA Intramuroso ni NIH. El NIH Nonhuman Primate Reagent Resource (R24 OD010976, U24 AI126683) proporcionó anti-CD3 y anti-CD28 utilizados en estos estudios. IL-2 utilizado en estos estudios fue proporcionado por el repositorio preclínico NCI. Agradecemos a nuestros colaboradores en este proyecto CD4-MBL CAR/CXCR5, la Dra. Elizabeth Connick en la Universidad de Arizona, el Dr. Edward A Berger en NIAID, NIH, la Dra. Eva G Rakasz en el Wisconsin National Primate Research Center y la Dra. Geoff Hart y la Sra. Preethi Haran en la Universidad de Minnesota, la Dra. Leslie Kean en la Escuela de Medicina de Harvard y la Dra. Catherine Bollard en el Instituto de Investigación Infantil. También agradecemos al Dr. Scott McIvor en la Universidad de Minnesota, al Dr. Christopher Peterson en el Centro de Cáncer Fred Hutchinson, al Dr. Matthew Trivett en el NIH, a la Dra. Agne Taraseviciute en el Hospital Infantil de Seattle y al Dr. Conrad Russell Cruz en el Instituto de Investigación Infantil por su ayuda muy útil para optimizar este protocolo. También reconocemos a la Sra. Chi Phan y a la Sra. Jhomary Alegria-Berrocal de la Universidad de Minnesota por la producción gammarretroviral, y a la Sra. Kim Weisgrau de la Universidad de Wisconsin-Madison por el aislamiento del pBMC de rhesus macaco.
Gammaretrovirus preparation | |||
0.025% Trypsin, 0.01% EDTA | Gibco | R-001-100 | |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
6 well plates, treated | CytoOne | CC7682-7506 | |
DMEM | Gibco | 10569-010 | |
Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | transfection reagent |
Opti-Mem | Invitrogen | 31985070 | reduced serum media |
pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | A gift from Dr. Patrick Salmon |
pMSGV1 containing CAR P2A CXCR5 | custom order from GenScript | ||
RD114 | A gift from Dr. Ed Berger | ||
T75 flasks | CytoOne | CC7682-4875 | |
VSV-G | pMD.G | A gift from Dr. Scott McIvor | |
T cell stimulation | |||
6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
Anti-CD28 | NHP Reagent Resource | Clone: CD28.2 | |
Anti-macaque CD3 | NHP Reagent Resource | Clone: FN18 | |
Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
Rhesus macaque PBMC or CD8 T cells | WNPRC | Primary cells | |
For Fibronectin coating | |||
6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
BSA (Fraction V) | HyClone | SH 30574.02 | |
RetroNectin (1 mg/ml) | TaKaRa | T100A | |
For T cell Expansion | |||
G-Rex 6 Well Plate | Wilson Wolf | P/N 80240M | Plates with gas permeable wells |
Media Components | |||
b mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
IL-2 | NCI Preclinical Repository | ||
Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
X-Vivo-15 medium | Lonza | 04-418Q | |
Variations of Media used | |||
Basic medium: | X-Vivo 15 medium, 10% heat-inactivated FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | ||
Expansion medium: | Growth medium + 50 mM b mercaptoethanol | ||
Growth medium: | Basic medium + 50 IU/ml IL-2 | Completion of media by addition of anti-CD28, IL-2 or b-mercaptoethanol should occur on the day of use. | |
Cell counting | |||
Countess cell counting chambers | Invitrogen | AMQAF1000 | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | |
Trypan blue, 0.4% solution | Invitrogen | T10282 | |
Flow Cytometry | |||
Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20186 | for conjugation of MBL antibody |
anti-CD28-BV605 | BD Biosciences | 562976 | |
anti-CD3-AF700 | BD Biosciences | 557917 | |
anti-CD4-FITC | BD Biosciences | 556615 | |
anti-CD8-BV788 | BD Biosciences | 563824 | |
anti-CD95-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 561655 | |
anti-CXCR5-PE | eBioscience | 12-1985-42 | |
anti-MBL | Invitrogen | MA1-40145-S6 | |
Flow Analysis software | FlowJo, LLC | FlowJo v10 | |
Flow Cytometer | Beckman | CytoFlex | |
Live/Dead Near IR | Invitrogen | L10119 | |
Other equipment | |||
Aerosolve canisters to contain aerosol leakage | Beckman | SX4750 | Safety equipment |
Beckman Allegra Centrifuge | Beckman | Sterilgard e3 | |
Cell culture incubator | Thermo Fisher | Everlast 247 | |
Class II Laminar flow hood | Baker | Heracell Vios 160i | |
Extra-Safe Disposable lab coat | Fisher Scientific | 359232 | Personal protective equipment |
Microplate carriers with biocertified covers | Beckman | SX4750A | Safety equipment |
Rocking platform | Benchmark | C10228 | |
Swinging bucket rotor | Beckman | X13-R | |
X-Gen Nitrile gloves | Genesee | Personal protective equipment |