Transductie en uitbreiding van primaire T-cellen in negen dagen met onderhoud van centraal geheugen Fenotype

OPMERKING: Dit rhesus PBMC transductieprotocol vereist het gebruik van een gammaretrovirale vector. Merk op dat gammaretrovirus kan worden geproduceerd in het lab of uitbesteed aan een virale productie bedrijf. In het lab kan de productie worden uitgevoerd met het protocol geschetst in stap 1 en het virus kan worden getitered zoals beschreven in stap 2. Of het virus nu ter plaatse of door een productiebedrijf wordt geproduceerd, een MOI (verhouding van infectieuze virions tot cellen in cultuur) moet worden bepaald, zoals beschreven in stap 3, voor elke nieuw geproduceerde virale bereiding en de cellen van belang. LET OP: Werken met gammaretrovirale vectoren of andere retrovirale vectoren vereist de juiste veiligheidsmaatregelen, zoals het gebruik van laboratoriumjassen en dubbele lagen handschoenen. Alle behandeling van het virus moet plaatsvinden in de bioveiligheidskap. Alle pipten moeten worden ontsmet in een oplossing van 10% bleekmiddel gedurende 30 min. Al het vloeibare infectieuze afval moet worden ontsmet met een uiteindelijke concentratie van 10% bleekmiddel. Secundaire insluiting, met een afdichting die het vrijkomen van microbiologische aerosolen voorkomt, is vereist voor centrifugering 1. Productie van de Gammaretrovirale voorraad Plaat 293T cellen voor transfection. Een volledig viruspreparaat vereist 12 T75-kolven bij 4,5 x 106 cellen/kolf in dulbecco’s gemodificeerde Eagle medium (DMEM) + 10% foetaal runderserum (FBS) zonder antibiotica. Laat de cellen ‘s nachts groeien bij 37 °C voor transfection. Verdun 60 μL transfection reagens in 1,5 mL verminderde serummedia. Bereid één buis voor elke kolf. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT. Bereid voor elke kolf een buis voor die 1,5 mL van verminderde serummedia en de volgende plasmiden bevat: 9,0 μg van een overdrachtsplasmide die het gen(en) van belang bevat, 3 μg RD114 en 1,2 μg VSV-G (envelopplasmiden) en 3 μg gag/pol.LET OP: De envelop en gag / pol genen zijn nodig voor retrovirale verpakking. Voor onze retrovirale productie voegen we zowel de RD114-envelop als, voor extra stabiliteit, een kleine hoeveelheid VSV-G-envelop toe. Voeg verdunde plasmiden (stap 1.4) toe aan verdund transfection reagens (stap 1.3). Meng voorzichtig. Incubeer gedurende 20 min bij kamertemperatuur. Voercellen 5 mL verse volledige media en voeg 3 mL transfection reagens/plasmitiemengsel druppelindeper kolf toe en incubeer gedurende 5-6 uur bij 37 °C. Voeg nog eens 5 ml vers medium toe aan de kolven en incubeer gedurende 42-43 uur bij 37 °C. Verzamel na een totale transfetietijd van 48 uur media en centrifugeer op 1282 x g gedurende 3 min bij 4 °C om celafval te verwijderen. Aliquot in de juiste volumes voor toekomstig gebruik, flash bevriezen het virus in een ethanol / droog ijs bad en op te slaan op -80 °C. 2. Titering van het Gammaretrovirus OPMERKING: Er kunnen verschillende verdunningen van het virus nodig zijn om een geldige titer te verkrijgen. Plaat 293T cellen bij 600.000 cellen/put in een 6-well plaat en incubeer de platen voor 24 uur bij 37 °C. Verwijder het medium uit de cellen en voeg de gewenste hoeveelheid DMEM + 10% FBS toe aan de 293T (2 mL totaal volume virus). Voeg het virus toe aan de overeenkomstige put en draai zachtjes om te mengen. Voeg bijvoorbeeld 200 μL, 100 μL, 50 μL en 25 μL toe aan respectievelijk 4 putten. Neem een put zonder virus voor flow cytometrie (mock sample). Incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C. Trypsinize de 293T cellen door het toevoegen van 0,5 mL trypsin-EDTA en incubatie voor 4 min bij 37 °C. Stop de trypsine door het toevoegen van 1,5 mL Van DMEM + 10% FBS. Tel de cellen en bepaal de levensvatbaarheid met een geautomatiseerd e-celteller of een hemocytometer. Als u het celtellerwilt gebruiken, voegt u 10 μL cellen toe aan 10 μL trypanblauw, mengt, laadt u de kamerdia en voegt u het in de toonbank in. Druk op de knop ‘vastleggen’ om de cellen te tellen. Verzamel 0,5-1 x 106 cellen en evalueer de niveaus van CAR en CXCR5 op flowcytometrie (zie stap 9.5). Expressie van CD4 of MBL samen met CXCR5 zal identificeren transduced 293T cellen co-expressing van de CAR en CXCR5. Zie reactieve antilichamen in stap 9.5.1. Bereken virale titer.LET OP: Kies het monster met een transductieniveau van 20% of minder voor de berekening van de titer. Gebruik de volgende formule om titer te berekenen:transductieeenheden/mL = (aantal cellen in kweek)(% van de getransducedcellen)/volume van het virus toegevoegd aan de cultuur 3. Het bepalen van de optimale MOI voor een nieuw geproduceerdviraal preparaat en de cellen van belang Volg het transductieprotocol (secties 4–9) met primaire PBMC’s en tweevoudige verdunningen van het gammaretrovirale preparaat. Beoordeel het expressieniveau van de genen van belang door stromingscytometrie (stap 9.5). Kies een concentratie van het virus dat maximale transductie mogelijk maakt zonder verlies van cel levensvatbaarheid. 4. Het voorbereiden van platen voor T Cell Activation door Coating Wells met Anti-CD3 Antilichamen Bereid anti-macaque CD3 antilichaam (FN18) voor door de voorraad te verdunnen tot 10 μg/mL in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Doser 2 mL/well in 6-well platen. Incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur. Als alternatief kunnen de platen ‘s nachts worden geïncubeerd bij 4 °C. Aanzuigen de PBS en ongebonden antilichamen. Spoel putten twee maal met 2 mL PBS en gebruik onmiddellijk om PBMC’s te borden. 5. Stimulerende Rhesus PBMC’s met plaatgebonden anti-CD3 en oplosbare anti-CD28 Ontdooi primaire rhesus PBMC’s in een waterbad van 37 °C, met zachte agitatie, totdat er slechts een kleine hoeveelheid ijs overblijft. In de kap, voorzichtig pipetteercellen in een kegelvormige buis. Spoel de flacon met 1 mL basismedium en voeg het langzaam toe aan de cellen. Voeg vervolgens langzaam een extra 9 mL warm basismedium toe aan de cellen.OPMERKING: Deze stap kan worden opgeschaald, maar ontdooinooit meer dan 4 flesjes tegelijk. Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 min bij 22 °C om de cellen te pelleteren. Aanzuigen de supernatant en vervolgens opnieuw schorsen van de pellet in een kleine hoeveelheid groei medium. Kies een volume zodanig dat de concentratie van cellen op dit punt meer dan 2 x 106 cellen/mL zal bedragen, aangezien de uiteindelijke concentratie 2 x 106 cellen/mL moet zijn. Vlekcellen met trypan blauw en tellen de cellen om het aantal levensvatbare cellen te bepalen.LET OP: Dit kan met een standaard hemocytometer of een geautomatiseerde celteller. We gebruiken een geautomatiseerde celteller die de levensvatbaarheid en het aantal levende cellen weergeeft. Om de teller te gebruiken, voegt u 10 μL cellen toe aan 10 μL trypan blauw, meng, laad de kamerdia en steek in de toonbank in. Druk op de knop ‘vastleggen’ om de cellen te tellen. Bereken het totale aantal cellen door de celconcentratie te vermenigvuldigen met volume en verdun de cellen vervolgens tot 2 x 106 cellen/mL in groeimedium. Voeg voorafgaand aan de beplating anti-CD28 toe aan een eindconcentratie van 5 μg/mL om een noodzakelijk co-stimulerend signaal te geven voor T-celactivering. Pipetteercellen in met anti-CD3 gecoate platen. Voeg 3-6 x 106 cellen per put toe (een goed doel is 4 x 106 cellen in 2 mL media per put) en incubeer gedurende 2 dagen bij 37 °C in 5% CO2. 6. Het voorbereiden van met Fibronectine gecoate platen OPMERKING: PBMC en T cellen express integrin receptoren VLA-4 of VLA-5 en zijn goede doelen voor fibronectine-gemedieerde transductie. Voorafgaand aan het coaten van de platen, eerst fibronectine reagens door verdunnen 1:100 in steriele PBS. Pipetteer 2 mL van de steriele fibronectineoplossing in elke put van een 6-well plaat. Voorzichtig rock platen voor 2 uur bij kamertemperatuur.OPMERKING: Niet-behandelde, celcultuur-grade weefsel cultuur borden of gerechten moeten worden gebruikt in deze stap. Verwijder de fibronectineoplossing door aspiratie en blokkeer vervolgens met 1 mL steriel 2% runderserumalbumine (BSA, Fractie V) in PBS. Rock de platen op kamertemperatuur voor 30 min. Vergde de BSA-oplossing en was de plaat met 2 mL PBS. Na aspiratie van de PBS kunnen de met fibronectine gecoate platen worden verzegeld met sealwrap en maximaal een week bij 4 °C worden bewaard.LET OP: We meestal bereiden de platen een dag voor transductie. 7. Transductie van geactiveerde rhesus PBMC’s LET OP: Werken met virale vectoren of met rhesus macaque PBMC’s vereist gebruik van de juiste veiligheidsmaatregelen, zoals het gebruik van laboratoriumjassen en dubbele lagen handschoenen. Alle behandeling van het virus en de cellen moet plaatsvinden in de bioveiligheidskap. Alle pipten moeten worden ontsmet in een oplossing van 10% bleekmiddel gedurende 30 min. Al het vloeibare infectieuze afval moet worden ontsmet met een uiteindelijke concentratie van 10% bleekmiddel. Secundaire insluiting met een afdichting die het vrijkomen van microbiologische aerosolen voorkomt, is vereist voor centrifugering. Bevestig de gammaretrovirale transducerende vector aan de met fibronectine bedekte put. Verwarm een centrifuge tot 32 °C door ongeveer 30 min op 2000 x g te lopen. Verwarm zowel serumvrij als groeimedia in een waterbad van 37 °C. Ontdooi het virus op ijs of door het flesje zachtjes te wervelen in een waterbad van 37 °C totdat er slechts een kleine hoeveelheid ijs overblijft. Om afbraak van de virale bereiding te voorkomen, laat u de inhoud niet opwarmen. Verdun het retrovirus tot een vooraf bepaalde optimale veelheid van infectie (MOI) in serumvrij medium.OPMERKING: Met ons gammaretrovirus en rhesus PBMC hebben we vastgesteld dat een MOI van 0,5 optimaal is. Voorbeeldverdunning: Om 4 putten met virus te coaten en 1,5 x 106 cellen toe te voegen, (4)(1,5 x 106)(0,5) = 3 x 106 TU zijn nodig. Als de virale titer 1.1 TU/mL is, gebruik dan 2.7 mL virus in 5.3 mL media voor een totaal volume van 8 mL. Voeg 2 mL verdund retrovirus toe aan elke put van de met fibronectine bedekte plaat. Voor negatieve controle mock-transduced cellen, voeg media alleen aan de fibronectine-gecoate putten. Plaats de platen in de voorverwarmde centrifuge van 32 °C in microplaatdragers met bioveilige afdekkingen en centrifugeer op 2000 x g gedurende 2 uur.LET OP: Met virussen bedekte platen kunnen onmiddellijk worden gebruikt of bij het virus ‘s nachts bij 4 °C worden opgeslagen. Voor onmiddellijk gebruik, aanzuigen het virus voorbereiding uit de putten en voeg 2 mL van groei medium. Voorkomt dat de met virussen bedekte putten niet drogen. Verguld de gestimuleerde PBMC’s. Controleer de cellen met behulp van een omgekeerde microscoop. De cellen moeten er gezond uitzien, wat betekent dat ze rond, helder en vuurvast licht zijn. Ze moeten ook een samengeklonterd uiterlijk vertonen dat stimulatie aangeeft. Verzamel de doelcellen en breng ze over naar een conische buis van 50 mL. Spoel de put eenmaal met 1 mL groeimedia en voeg toe aan de conische buis. Tel het aantal levende cellen met het geautomatiseerde celteller als in stap 5.4.OPMERKING: Gestimuleerde cellen worden samengeklonterd en dit samenklonteren kan leiden tot problemen bij het nauwkeurig tellen van de cellen. Pellet de cellen in de buizen door centrifugeren op 600 x g gedurende 5 min bij 32 °C. Aanzuigen van de media uit de cel pellet en resuspend de cellen in groei medium op een concentratie van 1,5 x 106 cellen/mL. Voeg aan elk goed met virussen bedekt (bereid in stap 7.1) 1 mL celsuspensie toe voor een totaal van 1,5 x 106 cellen/3 mL. Merk op dat elke put al 2 mL groeimedium bevat. Voer dezelfde stappen voor mock-transduced cellen, maar plaat ze op fibronectine-gecoate putten die geen virus ontvangen. Centrifugeer de platen op 1000 x g gedurende 10 min bij 32 °C. De platen voor 48 uur uitbroeden bij 37 °C onder 5% CO2. 8. Uitbreiding van de transgeïnduceerde cellen Trek de inhoud van de putten op en neer met een 5 mL pipet om de cellen opnieuw op te schorten en vervolgens over te dragen aan een kegelbuis van 50 mL. Voeg 1 mL groeimedia toe aan elke put en stel en neer met een steriele overdrachtpipet om aanhangende cellen te verwijderen. Cellen tellen om het totale celaantal en de levensvatbaarheid te bepalen met behulp van een geautomatiseerd celteller zoals in stap 5.4. Verwijder indien gewenst 1 x 106 cellen voor stroomcytometrie om genexpressie en fenotype te beoordelen. Zie stap 9.5.1 en de Materiaaltafel voor aanbevolen antilichamen en gatingstrategie. Centrifugeer de cellen op 600 x g gedurende 10 min bij 25 °C. De media aanzuigen en de cellen in expansiemedia opnieuw opschorten tot een concentratie van 1 x 106 cellen/mL. Zaad elke gasdoorlatende put van een 6-well plaat met 5 mL cellen. Leg voorzichtig een extra 25 mL expansiemedia per put.OPMERKING: We voegen de cellen toe in een klein volume en laag resterende media, zodat de cellen op de bodem van de put blijven. Incubeer de cellen 4 dagen ongestoord bij2 37 °C in 5% CO 2-incubator. 9. Verzameling van geëxpandeerde cellen en evaluatie van het fenotype van de transduced celpopulatie Verzamel cellen uit gasdoorlatende putten door het verwijderen en weggooien van 20 mL media. Voorzichtigheid is geboden om te voorkomen dat de cellen worden verstoord.OPMERKING: We breiden de cellen slechts 4 dagen uit en verzamelen de cellen op dit punt. Echter, als extra dagen van cultuur gewenst zijn, verwijder 20 mL van de media zonder verstoring van de cellen en vervang het door 20 mL van verse expansie media. Pipet de resterende media op en neer om de cellen los te maken. De media moeten zeer bewolkt zijn als de cellen goed zijn gegroeid. Met behulp van een steriele overdracht pipet, spoel elke put met 3 mL media om eventuele resterende cellen te verzamelen. Tel de cellen met de geautomatiseerde teller of een hemocytometer om te controleren op levensvatbaarheid en celnummer. Voercytometrie uit om transduced genexpressie en celfenotype te bepalen. In dit voorbeeld, bepalen rhesus macaque PBMC fenotype met behulp van antilichamen gericht tegen CD4 (M-T477), een kloon die reactief is met zowel endogene rhCD4 en de rhCD4-MBL CAR; tegen CD3 (SP34-2) en CD8 (RPA-T8) die respectievelijk de totale T-cellen en CD8 T-cellen bevlekken; tegen de doodreceptor CD95 (DX2) en het co-stimulerende molecuul CD28 (CD28.2) die worden gebruikt om het geheugenfenotype van de cellen te bepalen; en tegen CXCR5 (MU5UBEE) en MBL (3E7) om de CXCR5 en CD4-MBL CAR op de getransduced cells te detecteren. De beoordeling van de levensvatbaarheid werd beoordeeld met een vaste levensvatbaarheidskleurstof. Bereid cellen voor op stroomcytometrie. Make-up een antilichaam master mix voor het totale aantal buizen. Breng tot het totale volume met BEHULP van PBS. Voeg de cellen toe aan de buizen. Plaats 0,5-1 x 106 cellen per buis. Neem negatieve controles op, zoals niet-bevlekte cellen en bevlekte mock transduced cellen. Voeg 2 mL PBS toe aan de cellen, centrifugeer op 400 x g voor 5 min bij kamertemperatuur (RT) en decant. Voeg 100 μL antilichaammengsel toe aan de buizen en incubeer gedurende 30 min bij RT. Voeg 2 mL PBS toe, centrifugeer op 400 x g voor 5 min bij RT en decant. Voeg 300 μL van 1% paraformaldehyde toe en incubeer gedurende 15 min. Centrifugeer op 400 x g voor 5 min bij RT en decant. Voeg 300 μL PBS toe en meng. Op een flow cytometer, verwerven 150.000 gebeurtenissen voor elke steekproef. Analyseer de gegevens met flow analysis software.OPMERKING: De gating strategie werd eerder gepubliceerd20. Voor de identificatie van transgeïnduceerde cellen, poortcellen op lymfocyten, singlets, live, CD3+, en MBL + CXCR5+. Voor de identificatie van de centrale geheugenpopulatie, poortcellen op lymfocyten, singlets, live CD3+, CD8+, CD28+ CD95+. Gebruik cellen als dat nodig is. Cellen kunnen worden gebruikt voor in vitro testen van de functie, zoals een transwell migratie test9 of in vitro cel doden assays5,9. Cellen kunnen worden gebruikt voor infusie in dieren. Als alternatief u de resterende cellen in 90% FBS invriezen met 10% dimethylsulfoxide (DMSO) voor later gebruik of analyseOPMERKING: Hoewel een streefdosis voor infusie van adoptiecellen in een rhesus-macaque nog niet is vastgesteld, hebben gepubliceerde adoptiestudies bij niet-menselijke primaten 0,6 tot 1,2 x 107 cellen/kg21,1 tot 5 x 108 cellen/kg22 en 1,4 tot 8 x 108 cellen/kg10gebruikt. Met dit bereik als richtlijn kunnen met dit 9-daagse protocol voldoende cellen voor infusie worden geproduceerd.