Illustreremo un protocollo di 9 giorni per la trasduzione e l’espansione delle cellule mononucleari periferiche del macaco rhesus che produce cellule con un’eccellente co-espressione dei geni di interesse in numero sufficiente per gli studi di infusione dell’efficacia cellulare.
Le immunoterapie emergenti per il trattamento di malattie infettive e tumori spesso comportano la trasduzione di popolazioni cellulari con geni che codificano proteine che mirano alle malattie. Ad esempio, le cellule chihimeric antigene (CAR)-T per trattare i tumori e le infezioni virali comportano la trasduzione delle cellule T con geni sintetici che codificano molecole CAR. Le molecole CAR rendono le cellule T specificamente riconoscere e uccidere il cancro o le cellule viralmente infette. Le cellule possono anche essere co-transdotte con altri geni di interesse. Ad esempio, le cellule possono essere co-tradotte con geni che codificano proteine che prendono di mira le cellule in posizioni specifiche. Qui, presentiamo un protocollo per trasdurre le cellule mononucleari primarie del sangue periferico (PBMC) con geni che codificano una CAR specifica del virus e il recettore chemiochina della molecola del follicolo delle cellule B tipo 5 (CXCR5). Questa procedura richiede nove giorni e si traduce in popolazioni di cellule T trasdotte che mantengono un fenotipo della memoria centrale. Il mantenimento di una memoria centrale o di un fenotipo meno differenziato ha dimostrato di associarsi alla persistenza delle cellule post-infusione. Inoltre, le cellule prodotte con questo metodo mostrano alti livelli di vitalità, alti livelli di coespressione dei due geni trasdotti e grandi quantità sufficienti di cellule per l’infusione immunoterapeutica. Questo protocollo di nove giorni può essere ampiamente utilizzato per le cellule CAR-T e altri approcci di immunoterapia a cellule T. I metodi qui descritti si basano su studi presentati nelle nostre precedenti pubblicazioni.
Le immunoterapie cellulari stanno emergendo come un nuovo mezzo per trattare malattie tra cui tumori e malattie infettive. Questi metodi di immunoterapia spesso comportano la manipolazione genetica delle cellule terapeutiche per esprimere molecole specifiche. Ad esempio, le cellule T del recettore dell’antigene chimerico (CAR) sono progettate per esprimere una molecola CAR che ha un dominio extracellulare che lega specificamente le molecole sulle cellule malate e un dominio di segnalazione che attiva le cellule immunitarie per uccidere la cellula malata. Le cellule T CAR vengono utilizzate con successo nelle immunoterapie oncologiche e sono state particolarmente efficaci nel trattamento delle leucemie delle cellule B1,2,3. Anche le cellule CAR-T sono in fase di sviluppo per trattare infezioni virali come l’HIV. I CR specifici per l’HIV prendono di mira le proteine dell’involucro sulla superficie delle cellule infette viralmente4. Le cellule immunoterapeutiche possono anche essere progettate per esprimere molecole di homing per indirizzare le cellule terapeutiche a specifiche posizioni tissutali. Abbiamo sviluppato vettori che traducono sia una RCA specifica del virus che la molecola di sollevamento del follicolo linfoide CXCR55.
La replicazione virale di alcuni virus, tra cui il virus dell’immunodeficienza umana (HIV) e il virus dell’immunodeficienza simiana (SIV), è concentrata all’interno dei follicoli cellulari B nei tessuti linfoidi secondari6. I follicoli cellulari B sono siti privilegiati in qualche modo immuni in cui bassi livelli di CTL specifici per virus consentono la replicazione virale in corso7,8. Per questi motivi, indirizzare le cellule T specifiche dell’HIV/SIV nel follicolo attraverso l’espressione di CXCR5 è una strategia per l’eliminazione del serbatoio follicolare di cellule viralmente infette9,10. In particolare, stiamo prendendo di mira le cellule T CAR specifiche del SIV ai follicoli cellulari B tramite la co-espressione CXCR5.
In questo protocollo viene descritto un metodo per trasdurre CAR/CXCR5 ed espandere i PBMC per produrre cellule T CAR/CXCR5 di quantità sufficienti per l’infusione terapeutica. Le cellule trasdotte con questi metodi mantengono un fenotipo della memoria centrale. Gli studi hanno dimostrato che le cellule con un fenotipo meno differenziato, come le cellule T a memoria centrale e le cellule staminali della memoria T persistono meglio rispetto alle cellule più differenziate11,12. Inoltre, molti protocolli progettati per produrre cellule trasferite adottivamente hanno tempi di coltura relativamente lunghi che si traducono in cellule che hanno un fenotipo più differenziato e ridotta persistenza13. Inoltre, apportata trasferito cellule con lunghi tempi di coltura accumulati all’interno dei polmoni invece di tessuti linfoidi bersaglio nel macaco rhesus14,15. Nei metodi che descriviamo e dimostriamo qui, trasduciamo rapidamente ed espandiamo i PBMCC del macaco rhesus per produrre cellule T trasdotte che mantengono un fenotipo della memoria centrale.
Entrambe le cellule T CD4 e CD8 sono incluse nel nostro approccio immunoterapico. Questa popolazione di cellule miste è stata scelta perché, negli studi clinici, l’assenza di cellule T CD4 nel prodotto delle cellule T CD8 è stata correlata con un fallimento delle cellule T CD8 infuse per sistere 16. I metodi qui descritti iniziano attivando i PBMC con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 che stimolano potentemente il recettore delle cellule T e forniscono un segnale co-stimolante per evitare l’anergico clonale17,18.
Dopo l’attivazione, le cellule vengono trasdotte con un vettore gammaretrovirale che codifica una CAR specifica del virus e la molecola di homing linfoide CXCR5. Le cellule trasdotte vengono quindi espanse utilizzando piastre progettate per la propagazione delle cellule non aderenti che hanno una membrana permeabile al gas alla base. Questa membrana permette lo scambio di gas nella parte inferiore del pozzo che porta ad una maggiore sopravvivenza cellulare e disponibilità di nutrienti19. Utilizzando questi metodi, celle funzionali sufficienti possono essere prodotte in un lasso di tempo di 9 giorni per gli studi di infusione in vivo. Mentre questo protocollo è progettato per trasdurre ed espandere le cellule T del macaco rhesus, con una leggera modifica degli anticorpi attivanti specifici della specie, può essere utilizzato con cellule di altre specie. Questi metodi si basano sui nostri studi pubblicati in precedenza9,20.
Questo protocollo delinea una strategia di produzione di immunoterapia a cellule T che utilizza un vettore gammaretrovirale per trasdurre il macaco rhesus PBMC che conduce alla popolazione di cellule T che esprime una CAR antivirale e il recettore dell’homing follicolare, CXCR5. Con un totale di 8 giorni di tempo di coltura ex vivo, cellule CAR T vitali e funzionali sono prodotte in una quantità che è all’interno dell’intervallo pubblicato10,21,22 utilizzati per l’infusione in primati non umani per test di efficacia preclinica.
Il successo del protocollo di trasduzione si basa sia su PFC sani e stimolati che su preparati di qualità di gammaretrovirus. Al fine di ottenere una stimolazione e una trasduzione efficaci, è essenziale prestare particolare attenzione al congelamento e al trasporto dei PBMCC dopo la raccolta. Idealmente, se le cellule vengono raccolte fuori sede, vengono spedite in azoto liquido e rapidamente collocate nello stoccaggio di azoto liquido a lungo termine. Le PBMC devono essere mitoticamente attive per essere trasdotte con successo da un gammaretrovirus. Si dovrebbe monitorare visivamente per il clustering delle cellule dopo la stimolazione con anti-CD3/anti-CD28. Un mancato attivazione corretta causerà una bassa efficienza di trasduzione. È anche importante monitorare la vitalità nelle cellule stimolate. Scarsa vitalità dopo la fase di stimolazione di solito porta ad una trasduzione meno riuscita. Indipendentemente dal fatto che i preparati per i virus siano prodotti in laboratorio o in outsourcing, devono essere immagazzinati a -80 gradi centigradi in uso singolo per evitare cicli di congelamento del gelo che possono danneggiare il virus e compromettere l’efficienza della trasduzione. Il virus deve essere titered in modo che quantità coerenti di virus possono essere utilizzati in ogni esperimento. Quando si utilizza il virus per la trasduzione, scongelare il virus rapidamente e conservare sul ghiaccio fino a quando necessario. La scelta delle proteine promotore, potenziatore e involucro può influire sull’efficienza della trasduzione e sull’espressione del transgene nelle cellule bersaglio. Pertanto, un MOI deve essere determinato empiricamente. Inoltre, l’uso di un supporto progettato per supportare le cellule T e le piastre con pozzi permeabili al gas per l’espansione hanno portato a un’eccellente espansione delle cellule trasdotte. Tuttavia, c’è variabilità animale-animale nel tasso di espansione cellulare. Si consiglia uno studio di prova per determinare la capacità di una particolare preparazione cellulare da trasdurre ed espandere. I livelli di espansione sono coerenti sia nelle trasduzioni su piccola che in quello su larga scala.
Con l’uso di questo protocollo, abbiamo prodotto fino a 2,5 x 109 cellule per l’infusione in animali da esame. Anche se abbiamo ritenuto inutile aumentare il protocollo in questo momento, l’uso di 6 piastre di pozzo è una limitazione alla preparazione di celle su larga scala e il protocollo richiederebbe una modifica per produrre un maggior numero di cellule. Esempi di potenziali modifiche includono l’esecuzione della trasduzione in un sacchetto di coltura rivestito di fibronectina per aumentare il numero di cellule tradotte e utilizzare un vaso di coltura permeabile per gas più grande per la fase di espansione. Anche se non abbiamo ancora apportato queste modifiche, esse utilizzano prodotti disponibili in commercio e sono modifiche possibili al protocollo attuale.
Utilizzando questo metodo, abbiamo prodotto cellule trasdotte da PBMC isolati da animali non infetti, animali infetti da SIV e da animali infettati da SIV trattati con terapia antiretrovirale (ART). Tuttavia, abbiamo notato una riduzione dell’efficienza di trasduzione nelle cellule trattate con ART20. Questa riduzione è presumibilmente dovuta all’inibizione della trascrizione inversa e/o dell’integrasi da parte dei farmaci. Le trasduzioni di cellule da animali trattati con ART richiederanno modifiche a questo protocollo, come la riduzione dei livelli intracellulari dei farmaci ART, interrompendo ART per diversi giorni prima di raccogliere il PBMC o attraverso l’uso di un vettore alternativo che non è influenzato dai farmaci ART comunemente in uso.
È importante che le cellule prodotte per l’immunoterapia siano di un fenotipo minimamente differenziato in modo che persistano post-infusione12. Anche se molti protocolli per il trasferimento adottivo delle cellule richiedono tempi di coltura lunghi, un tempo di coltura ex vivo ridotto è stato correlato sia con una riduzione della differenziazione che con un miglioramento della funzione delle cellule CAR T13. Il lasso di tempo relativamente rapido di questo protocollo di trasduzione ed espansione consente il mantenimento del fenotipo della memoria centrale desiderato, pur producendo cellule sufficienti per testare il loro potenziale immunoterapeutico20.
L’obiettivo della strategia di produzione per questo prodotto di immunoterapia a cellule T è quello di produrre cellule T che riconosceranno le cellule infettate da SIV, si trasporterà verso il sito di replicazione virale nel follicolo delle cellule B e persisterà nell’animale con conseguente un lungo periodo cura funzionale senza bisogno di farmaci anti-retrovirali. Per la traduzione in un prodotto immunoterapico umano, questo protocollo può essere modificato per trasdurre le cellule T umane attraverso l’uso di anticorpi e citochine specifiche dell’uomo e l’attuazione di standard GMP con l’obiettivo finale di produrre una cura funzionale per Hiv.
The authors have nothing to disclose.
Questo studio è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH 5R01AI096966-06S1 (PS, CE ed EB), 1UM1AI26617 (PS, EC ed EB), P51OD011106/P51RR000167 (ER), MN REACH grant 5U01HL127479-03 (PS), 1R01A14 3380-01 (PS ed EB), 1UM14126617 (PS e EC) nonché fondi forniti dalla Divisione NIAID di Ricerca Intramurale e dal Programma Antivirale mirate NIH Intramurale AIDS. Anti-CD3 e anti-CD28 utilizzati in questi studi è stato fornito dal NIH Nonhuman Primate Reagent Resource (R24 OD010976, U24 AI126683). Il-2 utilizzato in questi studi è stato fornito da The NCI Preclinical Repository. Ringraziamo i nostri collaboratori in questo progetto CD4-MBL CAR/CXCR5, la dott.ssa Elizabeth Connick presso l’Università dell’Arizona, il Dr. Edward A Berger presso NIAID, NIH, Dr. Eva G Rakasz presso il Wisconsin National Primate Research Center e la dott.ssa Geoff Hart e la signora Preethi Haran presso l’Università del Minnesota, il dottor Leslie Kean presso la Harvard Medical School e la dott.ssa Catherine Bollard presso il Children’s Research Institute. Ringraziamo anche il Dr. Scott McIvore presso l’Università del Minnesota, il Dr. Christopher Peterson al Fred Hutchinson Cancer Center, il Dr. Matthew Trivett al NIH, Dr. Agne Taraseviciute presso il Seattle Children’s Hospital, e il Dr. Conrad Russell Cruz presso il Children’s Research Institute per la loro assistenza molto utile nell’ottimizzazione di questo protocollo. Ringraziamo anche la signora Chi Phan e la signora Jhomary Alegria-Berrocal dell’Università del Minnesota per la produzione gammaretrovirale, e Kim Weisgrau presso l’Università del Wisconsin-Madison per l’isolamento del macaco rhesus PBMC.
Gammaretrovirus preparation | |||
0.025% Trypsin, 0.01% EDTA | Gibco | R-001-100 | |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
6 well plates, treated | CytoOne | CC7682-7506 | |
DMEM | Gibco | 10569-010 | |
Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | transfection reagent |
Opti-Mem | Invitrogen | 31985070 | reduced serum media |
pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | A gift from Dr. Patrick Salmon |
pMSGV1 containing CAR P2A CXCR5 | custom order from GenScript | ||
RD114 | A gift from Dr. Ed Berger | ||
T75 flasks | CytoOne | CC7682-4875 | |
VSV-G | pMD.G | A gift from Dr. Scott McIvor | |
T cell stimulation | |||
6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
Anti-CD28 | NHP Reagent Resource | Clone: CD28.2 | |
Anti-macaque CD3 | NHP Reagent Resource | Clone: FN18 | |
Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
Rhesus macaque PBMC or CD8 T cells | WNPRC | Primary cells | |
For Fibronectin coating | |||
6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
BSA (Fraction V) | HyClone | SH 30574.02 | |
RetroNectin (1 mg/ml) | TaKaRa | T100A | |
For T cell Expansion | |||
G-Rex 6 Well Plate | Wilson Wolf | P/N 80240M | Plates with gas permeable wells |
Media Components | |||
b mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
IL-2 | NCI Preclinical Repository | ||
Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
X-Vivo-15 medium | Lonza | 04-418Q | |
Variations of Media used | |||
Basic medium: | X-Vivo 15 medium, 10% heat-inactivated FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | ||
Expansion medium: | Growth medium + 50 mM b mercaptoethanol | ||
Growth medium: | Basic medium + 50 IU/ml IL-2 | Completion of media by addition of anti-CD28, IL-2 or b-mercaptoethanol should occur on the day of use. | |
Cell counting | |||
Countess cell counting chambers | Invitrogen | AMQAF1000 | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | |
Trypan blue, 0.4% solution | Invitrogen | T10282 | |
Flow Cytometry | |||
Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20186 | for conjugation of MBL antibody |
anti-CD28-BV605 | BD Biosciences | 562976 | |
anti-CD3-AF700 | BD Biosciences | 557917 | |
anti-CD4-FITC | BD Biosciences | 556615 | |
anti-CD8-BV788 | BD Biosciences | 563824 | |
anti-CD95-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 561655 | |
anti-CXCR5-PE | eBioscience | 12-1985-42 | |
anti-MBL | Invitrogen | MA1-40145-S6 | |
Flow Analysis software | FlowJo, LLC | FlowJo v10 | |
Flow Cytometer | Beckman | CytoFlex | |
Live/Dead Near IR | Invitrogen | L10119 | |
Other equipment | |||
Aerosolve canisters to contain aerosol leakage | Beckman | SX4750 | Safety equipment |
Beckman Allegra Centrifuge | Beckman | Sterilgard e3 | |
Cell culture incubator | Thermo Fisher | Everlast 247 | |
Class II Laminar flow hood | Baker | Heracell Vios 160i | |
Extra-Safe Disposable lab coat | Fisher Scientific | 359232 | Personal protective equipment |
Microplate carriers with biocertified covers | Beckman | SX4750A | Safety equipment |
Rocking platform | Benchmark | C10228 | |
Swinging bucket rotor | Beckman | X13-R | |
X-Gen Nitrile gloves | Genesee | Personal protective equipment |