Merkezi Bellek Fenotip Bakımı ile Dokuz Günde Primer T Hücrelerinin Transdüksiyonu ve Genişlemesi

NOT: Bu rhesus PBMC transdüksiyon protokolü bir gammaretroviral vektör kullanımını gerektirir. Gammaretrovirus ya laboratuvarda üretilebilir ya da bir viral üretim şirketi için dış kaynaklı unutmayın. Laboratuvar üretiminde adım 1’de belirtilen protokol ile yapılabilir ve virüs 2. Virüsün yerinde mi yoksa bir üretim şirketi tarafından mı üretildiği, her yeni üretilen viral hazırlık ve ilgi hücreleri için 3. DİkKAT: Gammaretroviral vektörler veya diğer retroviral vektörlerle çalışmak, laboratuvar önlükleri ve çift katmanlı eldiven kullanımı gibi uygun güvenlik önlemleri gerektirir. Virüsün tüm kullanımı biyogüvenlik başlığında meydana gelmelidir. Tüm pipetler 30 dakika boyunca çamaşır suyu çözeltisi içinde dekontamine edilmelidir. Tüm sıvı enfeksiyöz atıklar son konsantrasyonla dekontamine edilmelidir. Mikrobiyolojik aerosollerin salınımını engelleyen bir mühürle ikincil çevreleme, santrifüj için gereklidir 1. Gammaretroviral Stok Üretimi Transfeksiyon için plaka 293T hücreleri. Tam bir virüs hazırlığı için Dulbecco’nun modifiye Kartal ortamında (DMEM) + fetal sığır serumunda (FBS) antibiyotiksiz olarak 4.5 x 106 hücre/şişede 12 T75 şişesi gerekir. Hücrelerin transfeksiyondan önce bir gecede 37 °C’de büyümesine izin verin. 1,5 mL azaltılmış serum media transfeksiyon reaktifi 60 μL seyreltin. Her şişe için bir tüp hazırlayın. RT’de 5 dakika kuluçkaya yat. Her şişe için, 1,5 mL azaltılmış serum media ve aşağıdaki plazmidiçeren bir tüp hazırlayın: 9.0 g bir transfer plazmidi geni(ler) içeren ilgi, 3 μg RD114 ve 1.2 g VSV-G (zarf plazmidleri) ve 3 μg gag/pol.NOT: Retroviral ambalaj için zarf ve gag/pol genleri gereklidir. Retroviral üretimiçin hem RD114 zarfını hem de daha fazla stabilite için az miktarda VSV-G zarfını ekliyoruz. Seyreltilmiş transfeksiyon reaktifine seyreltilmiş plazmidler (adım 1.4) ekleyin (adım 1.3). Yavaşça karıştırın. Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka. Yem hücreleri 5 mL taze tam ortam ve 3mL transfeksiyon reaktifi / plazmid karışımı şişe başına damla ve 37 °C’de 5-6 saat kuluçka ekleyin. Şişelere 5 mL daha taze ortam ekleyin ve 37 °C’de 42-43 saat kuluçkaya yatırın. Toplam 48 h’lik transfeksiyon süresinden sonra, hücre enkazını temizlemek için 1282 x g’de 3 dk 4 °C’de ortam ve santrifüj toplayın. Aliquot ileride kullanım için uygun hacimlerde, flaş bir etanol / kuru buz banyosunda virüs dondurma ve -80 °C’de saklamak. 2. Gammaretrovirus titering NOT: Geçerli bir titre elde etmek için birkaç virüs seyreltme gerekli olabilir. Plaka 293T hücreleri 600.000 hücre/iyi 6-iyi bir plaka ve 37 °C’de 24 saat için plaka kuluçka. 293T’ye (2 mL toplam virüs hacmi) istediğiniz miktarda DMEM + FBS ekleyin. Ilgili kuyuya virüs ekleyin ve yavaşça karıştırmak için girdap. Örneğin, 4 kuyuya sırasıyla 200°L, 100°L, 50 μL ve 25°L ekleyin. Akış sitometrisi (sahte örnek) için virüssüz bir kuyu ekleyin. 37 °C’de 48 saat kuluçka. 293T hücreleri 0,5 mL Trypsin-EDTA ekleyerek ve 37 °C’de 4 dakika kuluçkaya yatırarak deneyin. 1,5 mL DMEM + FBS ekleyerek tripsini durdurun. Hücreleri sayın ve otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre ile canlılığı belirleyin. Hücre sayacını kullanmak için 10 μL’lik hücreleri trypan mavisine 10 μL ekleyin, karıştırın, hazne slaytını yükleyin ve tezgaha takın. Hücreleri saymak için “yakala” düğmesine basın. 0.5-1 x 106 hücreleri toplayın ve akış sitometrisine göre CAR ve CXCR5 düzeylerini değerlendirin (bkz. adım 9.5). CD4 veya MBL’nin CXCR5 ile birlikte ekspresyonu, CAR ve CXCR5’i birlikte ifade eden transduced 293T hücrelerini tanımlar. 9.5.1.’deki reaktif antikorları görün. Viral titreyi hesapla.NOT: Titre hesaplamak için veya daha az transdüksiyon düzeyine sahip numuneyi seçin. Titreyi hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:transdüksiyon birimleri/mL = (kültürdeki hücre sayısı)transen hücrelerin inkişa mı)/virüs hacmi kültüre eklendi 3. Yeni Üretilen Viral Hazırlık ve İlgi Hücreleri için Optimal MOI belirlenmesi Birincil PBMC’ler ve gammaretroviral preparatın iki kat seyreltmeleri ile transdüksiyon protokolünü (bölüm 4-9) uygulayın. Akış sitometrisi ile ilgi genlerinin ifade düzeyini değerlendirin (adım 9.5). Hücre canlılığı kaybı olmadan maksimal transdüksiyon sağlayan virüs konsantrasyonu seçin. 4. Anti-CD3 Antikorları ile Kaplayarak T Hücre Aktivasyonu için Plakahazırlama Kuyular Fosfat tamponlu salinde (PBS) stoku 10 μg/mL’ye seyrelterek antimakak CD3 antikor (FN18) hazırlayın. 6 kuyulu tabaklarda 2 mL/kuyu dağıtın. 37 °C’de 2 saat boyunca kuluçkaya yatan plakalar bir gecede 4 °C’de kuluçkaya yayılabilir. PBS ve bağlanmamış antikorları aspire edin. 2 mL PBS ile iki kez durulayın ve hemen plaka PBMC’leri kullanın. 5. Uyarıcı Rhesus PBMCs Plaka bağlı Anti-CD3 ve Çözünür Anti-CD28 ile 37 °C’lik bir su banyosunda, hafif bir ajitasyonla, sadece küçük bir miktar buz kalana kadar birincil rhesus PBMC’leri eritin. Kaputun içinde, konik bir tüp içine yavaşça pipet hücreleri. Temel orta 1 mL ile şişe durulayın ve hücrelere yavaş yavaş ekleyin. Daha sonra, yavaş yavaş hücrelere sıcak temel orta ek bir 9 mL ekleyin.NOT: Bu adım büyütülebilir, ancak aynı anda 4 şişeden fazla şişeyi eritemez. Hücreleri peletlemek için 22 °C’de 5 dk için 600 x g’de santrifüj. Supernatant aspire ve daha sonra büyüme orta küçük bir miktar pelet resuspend. Son konsantrasyon 2 x 106 hücre/mL olması gerektiğinden, bu noktada hücre konsantrasyonunun 2 x 106 hücre/mL’yi aşacağı bir hacim seçin. Trypan mavi ile hücreleri leke ve canlı hücrelerin sayısını belirlemek için hücreleri saymak.NOT: Bu standart bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı ile yapılabilir. Canlı hücrelerin canlılığını ve sayısını gösteren otomatik bir hücre sayacı kullanıyoruz. Sayacı kullanmak için 10 μL’lik hücreleri 10 μL’lik trypan mavisine ekleyin, karıştırın, hazne kaydırasını yükleyin ve tezgaha takın. Hücreleri saymak için “yakala” düğmesine basın. Hücre konsantrasyonu hacmi ile çarparak hücre toplam sayısını hesaplayın ve daha sonra büyüme orta 2 x 106 hücreleri / mL hücreleri seyreltmek. Kaplamadan önce, T hücre aktivasyonu için gerekli bir uyarıcı sinyali sağlamak için 5 g/mL’lik son konsantrasyona anti-CD28 ekleyin. Pipette hücreleri anti-CD3 kaplı plakalar içine. Kuyu başına 3-6 x 106 hücre ekleyin (iyi bir hedef kuyu başına 2 mL ortamda 4 x 106 hücredir) ve O2’de 37 °C’de 2 gün kuluçkaya yatırın. 6. Fibronektin Kaplı Plakaların Hazırlanması NOT: PBMC ve T hücreleri integrin reseptörlerini VLA-4 veya VLA-5 olarak ifade eder ve fibronektin aracılı transdüksiyon için iyi hedeflerdir. Plakaları kaplamadan önce, 1:100’ü steril PBS’de seyrelterek fibronektin reaktifini hazırlayın. Pipet 2 mL steril fibronektin çözeltisi 6 kuyulu bir plakanın her kuyuiçine. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca hafifçe kaya plakaları.NOT: Bu adımda tedavi edilmeyen, hücre kültürü sınıf doku kültür plakaları veya yemekleri kullanılmalıdır. Aspirasyon ile fibronektin çözeltisini çıkarın ve PBS’de 1 mL steril %2 büyükbaş serum albumini (BSA, Fraksiyon V) ile bloke edin. 30 dakika oda sıcaklığında plakaları sallayın. BSA çözeltisini aspire edin ve plakayı 2 mL PBS ile yıkayın. PBS aspirasyonundan sonra, fibronektin kaplı plakalar mühür sargı ile kapatılabilir ve 4 °C’de bir haftaya kadar saklanabilir.NOT: Plakaları genellikle transdüksiyondan bir gün önce hazırlıyoruz. 7. Aktif rhesus PBMCs transdüksiyon DİkKAT: Viral vektörlerle veya rhesus makak PBMC’lerle çalışmak, laboratuvar önlükleri ve çift kat eldiven kullanımı gibi uygun güvenlik önlemlerinin kullanılmasını gerektirir. Virüsün ve hücrelerin tüm kullanımı biyogüvenlik başlığında meydana gelmelidir. Tüm pipetler 30 dakika boyunca çamaşır suyu çözeltisi içinde dekontamine edilmelidir. Tüm sıvı enfeksiyöz atıklar son konsantrasyonla dekontamine edilmelidir. Mikrobiyolojik aerosollerin salınımını engelleyen bir mühür ile ikincil çevreleme, santrifüj için gereklidir. Gammaretroviral transducing vektörü fibronektin kaplı kuyuya takın. Yaklaşık 30 dakika boyunca 2000 x g’de koşarak 32 °C’ye kadar bir santrifüj ısıtın. 37 °C’lik bir su banyosunda hem serumsuz hem de büyüme ortamını ısıtın. Virüsü buzüzerinde eritin veya şişeyi 37 °C’lik bir su banyosunda hafifçe döndürerek sadece küçük miktarda buz kalana kadar eritin. Viral hazırlık bozulmasını önlemek için, içeriğini ısınmak için izin vermez. Retrovirüsü serumsuz ortamda önceden belirlenmiş optimal enfeksiyon çokluğu (MOI) ile seyreltin.NOT: Gammaretrovirus ve rhesus PBMC ile 0.5 moi’nin en uygun olduğunu bulduk. Örnek seyreltme: 4 kuyuyu virüsle kaplamak ve 1.5 x 106 hücre eklemek için (4)(1.5 x 106)(0.5) = 3 x 106 TU gereklidir. Viral titre 1.1 TU/mL ise, toplam 8 mL hacim için 5.3 mL ortamda 2.7 mL virüs kullanın. Fibronektin kaplı plakanın her kuyuya 2 mL seyreltilmiş retrovirüs ekleyin. Negatif kontrol mock-transduced hücreleri için, fibronektin kaplı kuyulara tek başına medya ekleyin. Plakaları önceden ısıtılmış 32 °C santrifüje biyogüvenli kapaklı mikroplaka taşıyıcılarına yerleştirin ve 2 000 x g’de 2 saat santrifüj edin.NOT: Virüs kaplı plakalar bir gecede 4 °C’de virüsle birlikte hemen kullanılabilir veya saklanabilir. Hemen kullanım için, kuyulardan virüs hazırlığı aspire ve büyüme orta 2 mL ekleyin. Virüs kaplı kuyuların kuruması için saklayın. Uyarılan PBMC’leri plakalayın. Ters mikroskop kullanarak hücreleri kontrol edin. Hücreler sağlıklı görünmelidir, yani yuvarlak, parlak ve ışığı kırmalıdırlar. Onlar da stimülasyon gösteren bir kümeli görünüm göstermelidir. Hedef hücreleri toplamak ve 50 mL konik tüp aktarın. 1 mL büyüme ortamı ile kuyuyu bir kez durulayın ve konik tüpe ekleyin. 5.4 adımda olduğu gibi otomatik hücre sayacı ile canlı hücrelerin sayısını sayın.NOT: Uyarılmış hücreler kümelenir ve bu kümelenme hücreleri doğru saymada zorluklara yol açabilir. 32 °C’de 5 dk için 600 x g’de santrifüj ederek tüplerdeki hücreleri peletleyin. Hücre peletinden ortam aspirasyon ve 1.5 x 106 hücre/mL konsantrasyonda büyüme ortamı hücreleri resuspend. Her virüs kaplı iyi (adım 7.1 hazırlanan) toplam 1.5 x 106 hücre / 3 mL için hücre süspansiyon 1 mL ekleyin. Her kuyunun zaten 2 mL büyüme ortamı içerdiğini unutmayın. Sahte transeksed hücreler için aynı adımları gerçekleştirin ama hiçbir virüs aldı fibronektin kaplı kuyular üzerine plaka. 32 °C’de 10 dk için 1000 x g plakaları santrifüj. Plakaları %5 CO2’ninaltında 37 °C’de 48 saat kuluçkaya yatırın. 8. Transeksyon hücrelerinin genişlemesi Hücreleri yeniden askıya almak ve daha sonra 50 mL konik bir boruya aktarmak için kuyuların içindekileri 5 mL pipet ile yukarı ve aşağı çekin. Her kuyuya 1 mL büyüme ortamı ekleyin ve yapışık hücreleri temizlemek için steril bir aktarım pipeti ile yukarı ve aşağı çizin. 5.4 adımda olduğu gibi otomatik bir hücre sayacı kullanarak toplam hücre sayısını ve canlılığı belirlemek için hücreleri sayın. İstenirse, gen ekspresyonu ve fenotip değerlendirmek için akış sitometrisi için 1 x 106 hücreyi çıkarın. Önerilen antikorlar ve gating stratejisi için adım 9.5.1 ve Malzeme Tablosu’na bakın. Hücreleri 600 x g’de 10 dk 25 °C’de santrifüj edin. Ortamı aspire edin ve genişleme medyasındaki hücreleri 1 x 106 hücre/mL konsantrasyonuna yeniden askıya alın. 5 mL hücreli 6 kuyulu bir tablanın her gaz geçirgen kuyusu tohumlayın. Kuyu başına ek 25 mL’lik bir genişletme ortamını dikkatlice katmanlayın.NOT: Hücreleri küçük bir hacim halinde ekliyoruz ve kalan ortamları katmanlıyoruz, böylece hücreler kuyunun dibinde kalıyor. Hücreleri 37 °C’de %5 CO2 kuluçka makinesinde 4 gün boyunca kuluçkaya yatırın. 9. Genişletilmiş hücrelerin toplanması ve transdükse hücre popülasyonunun fenotipinin değerlendirilmesi 20 mL ortam çıkararak ve atarak gaz geçirgen kuyularından hücreleri toplayın. Hücreleri rahatsız etmemek için dikkatli olunmalıdır.NOT: Hücreleri sadece 4 gün genişletiyoruz ve bu noktada hücreleri topluyoruz. Ancak, ek kültür günleri isteniyorsa, hücreleri rahatsız etmeden 20 mL’lik ortamı çıkarın ve 20 mL taze genişleme ortamıyla değiştirin. Hücreleri yerinden çıkarmak için kalan ortamı yukarı ve aşağı boruyla titretin. Hücreler iyi büyümüşse medya çok bulutlu olmalıdır. Steril bir aktarım pipeti kullanarak, artık hücreleri toplamak için her kuyuyu 3 mL ortamla durulayın. Canlılık ve hücre numarasını kontrol etmek için otomatik sayaç veya hemositometre ile hücreleri sayın. Transduced gen ekspresyonu ve hücre fenotipini belirlemek için akış sitometrisi yapın. Bu örnekte, hem endojen rhCD4 hem de rhCD4-MBL CAR ile reaktif olan CD4 (M-T477) karşı antikorlar kullanarak rhesus makak PBMC fenotipini belirleyin; cd3 (SP34-2) ve CD8 (RPA-T8) sırasıyla toplam T hücreleri ve CD8 T hücreleri leke karşı; hücrelerin hafıza fenotipini belirlemek için kullanılan cd95 (DX2) ve ortak uyarıcı molekül CD28 ‘e (CD28.2) karşı; ve CXCR5 (MU5UBEE) ve MBL (3E7) karşı transduced hücrelerde CXCR5 ve CD4-MBL CAR tespit etmek. Canlılığı değerlendirin, düzeltilebilir bir canlılık boyası ile değerlendirildi. Akış sitometrisi için hücreleri hazırlayın. Tüplerin toplam sayısı için bir antikor ana karışımı makyaj. PBS kullanarak toplam hacmi kadar getirin. Akış tüpleri hücreleri ekleyin. Tüp başına 0,5-1 x 106 hücre yerleştirin. Lekelenmemiş hücreler gibi negatif kontroller ve lekeli sahte transdükse hücreleri ekleyin. Hücrelere 2 mL PBS, oda sıcaklığında 5 dk (RT) ve decant için 400 x g santrifüj ekleyin. Tüplere 100 μL antikor karışımı ekleyin ve RT’de 30 dakika kuluçkaya yatırın. 2 mL PBS, 400 x g’de 5 dk RT ve decant santrifüj ekleyin. 15 dakika boyunca % 1 paraformaldehit ve kuluçka 300 μL ekleyin. 400 x g’de sentrifuge 5 dk RT ve decant. 300 μL PBS ekleyin ve karıştırın. Akış sitometresi üzerinde, her örnek için 150.000 olay edinin. Akış analizi yazılımı ile verileri analiz edin.NOT: Gating stratejisi daha önce20yayınlanmıştır . Transekte hücrelerin belirlenmesi için, lenfositler, singlets, canlı, CD3 + ve MBL + CXCR5 + kapı hücreleri. Merkezi bellek popülasyonunun belirlenmesi için, lenfositler, singletlar, canlı CD3+, CD8+, CD28+ CD95+ üzerindeki kapı hücreleri. Hücreleri gerektiği gibi kullanın. Hücreler fonksiyonun in vitro tahliller için kullanılabilir, transwell göç tahlil gibi9 veya in vitro hücre öldürme tahlilleri5,9. Hücreler hayvanlara infüzyon için kullanılabilir. Alternatif olarak, kalan hücreleri FBS’de dimetil sülfoksit (DMSO) ile dondurarak daha sonra kullanmak veya analiz etmek içinNOT: Evlat edinilen hücrelerin rhesus makak içine infüzyonu için hedef doz henüz belirlenmemekle birlikte, insan olmayan primatlarda yayınlanan evlat edinme transfer çalışmaları 0.6 ila 1.2 x 107 hücre/kg21,1 ila 5 x 108 hücre/kg22 ve 1.4-8 x 108 hücre/kg10. Bir kılavuz olarak bu aralık ile, infüzyon için yeterli hücre bu 9 günlük protokol ile üretilebilir.