Delineamos um protocolo de 9 dias para a transdução e expansão de células mononucleares periféricas rhesus macaque que produz células com excelente co-expressão dos genes de interesse em número suficiente para estudos de infusão da eficácia celular.
Imunoterápicos emergentes para tratar doenças infecciosas e cânceres geralmente envolvem a transdução de populações celulares com genes que codificam proteínas que visam doenças. Por exemplo, as células quiméricas do receptor de antígeno (CAR)-T para tratar cânceres e infecções virais envolvem a transdução de células T com genes sintéticos codificando moléculas car. As moléculas car fazem as células T reconhecerem especificamente e matarem o câncer ou as células infectadas viralmente. As células também podem ser co-transduzidas com outros genes de interesse. Por exemplo, as células podem ser co-transduzidas com genes codificando proteínas que visam as células para locais específicos. Aqui, apresentamos um protocolo para transduzir células mononucleares periféricas primárias (PBMCs) com genes codificando um CAR específico para vírus e o folículo b células que homing molécula quimokina receptor tipo 5 (CXCR5). Este procedimento leva nove dias e resulta em populações de células T transduzidas que mantêm um fenótipo de memória central. A manutenção de uma memória central ou fenótipo menos diferenciado tem sido demonstrada associada à persistência de células pós-infusão. Além disso, as células produzidas com este método apresentam altos níveis de viabilidade, altos níveis de co-expressão dos dois genes transduzidos e grandes quantidades de células para infusão imunoterapêutica. Este protocolo de nove dias pode ser amplamente utilizado para células CAR-T e outras abordagens de imunoterapia celular T. Os métodos descritos aqui são baseados em estudos apresentados em nossas publicações anteriores.
As imunoterapias celulares estão surgindo como um novo meio de tratar doenças, incluindo cânceres e doenças infecciosas. Esses métodos de imunoterapia geralmente envolvem manipulação genética de células terapêuticas para expressar moléculas específicas. Por exemplo, as células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) são projetadas para expressar uma molécula CAR que tem um domínio extracelular que liga especificamente moléculas em células doentes e um domínio de sinalização que aciona as células imunes para matar a célula doente. As células CAR T estão sendo usadas com sucesso em imunoterápicos cancerígenos, e têm sido particularmente eficazes no tratamento de leucemias de células B1,2,3. Células CAR-T também estão sendo desenvolvidas para tratar infecções virais como o HIV. As CARs específicas para o HIV visam as proteínas envelope na superfície das células infectadas viralmente4. As células imunoterapêuticas também podem ser projetadas para expressar moléculas de homing para atingir células terapêuticas a locais específicos do tecido. Desenvolvemos vetores que transdutem tanto um CAR específico para o vírus como a molécula de homículo linfóide CXCR55.
A replicação viral de alguns vírus, incluindo o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e o vírus da imunodeficiência símia (SIV), está concentrada dentro de folículos de células B em tecidos linfóides secundários6. Folículos de células B são locais um pouco privilegiados imunológicos nos quais baixos níveis de CTL específicos do vírus permitem a replicação viral contínua7,8. Por essas razões, direcionar células T específicas do HIV/SIV para o folículo através da expressão de CXCR5 é uma estratégia para a eliminação do reservatório folicular de células infectadas viralmente9,10. Especificamente, estamos mirando células CAR T específicas do SIV para folículos celulares B via co-expressão CXCR5.
Neste protocolo descrevemos um método para transduzir CAR/CXCR5 e expandir PBMCs para produzir células CAR/CXCR5 T de quantidades suficientes para infusão terapêutica. As células transduzidas com esses métodos mantêm um fenótipo de memória central. Estudos têm demonstrado que as células com um fenótipo menos diferenciado, como células T de memória central e células-tronco da memória T, persistem melhor do que as células mais diferenciadas11,12. Além disso, muitos protocolos projetados para produzir células transferidas de forma adotiva têm tempos de cultura relativamente longos que resultam em células que possuem um fenótipo mais diferenciado e persistência reduzida13. Além disso, as células adotadas transferidas com longos tempos de cultura acumulados dentro dos pulmões em vez de tecidos linfóides alvo no resus macaque14,15. Nos métodos que descrevemos e demonstramos aqui, rapidamente transdutramos e expandimos pbmcs de macaque rhesus para produzir células T transduzidas que mantêm um fenótipo de memória central.
As células CD4 e CD8 T estão incluídas em nossa abordagem de imunoterapia. Essa população de células mistas foi escolhida porque, em ensaios clínicos, a ausência de células T CD4+ no produto celular CD8+ T foi correlacionada com uma falha das células CD8 T infundidas para persistir 16. Os métodos descritos aqui começam ativando PBMCs com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 que estimulam potentemente o receptor de células T e fornecem um sinal de co-estimulação para evitar a enérgia clonal17,18.
Após a ativação, as células são transduzidas com um vetor gamaretroviral codificando um CAR específico para vírus e a molécula de homing linfóide CXCR5. As células transduzidas são então expandidas usando placas projetadas para propagação celular não aderente que têm uma membrana permeável a gás na base. Esta membrana permite a troca de gás na parte inferior do poço, levando a uma maior sobrevivência celular e disponibilidade de nutrientes19. Usando esses métodos, células funcionais suficientes podem ser produzidas em um prazo de 9 dias para estudos de infusão in vivo. Embora este protocolo seja projetado para transduzir e expandir células T de rhesus macaque, com leve modificação dos anticorpos ativadores específicos da espécie, ele pode ser usado com células de outras espécies. Esses métodos são baseados em nossos estudos publicados anteriormente9,20.
Este protocolo descreve uma estratégia de produção de imunoterapia celular T que utiliza um vetor gamaretroviral para transdutor rhesus macaque PBMC levando à população de células T que expressa um CAR antiviral, bem como o receptor de homing folicular, CXCR5. Com um total de 8 dias de tempo de cultura ex vivo, as células CAR T viáveis e funcionais são produzidas em uma quantidade que está dentro da faixa publicada10,21,22 utilizadas para infusão em primatas não humanos para testes de eficácia pré-clínica.
O sucesso do protocolo de transdução depende tanto de PBMCs saudáveis e estimulados quanto de preparações de qualidade do gamaretrovírus. Para alcançar a estimulação e a transdução bem sucedidas, é essencial que os cuidados adequados seja tomado no congelamento e transporte dos PBMCs após a coleta. Idealmente, se as células são coletadas fora do local, elas são enviadas em nitrogênio líquido e rapidamente colocadas em armazenamento de nitrogênio líquido a longo prazo. Os PBMCs devem ser mitoticamente ativos para serem transdutados com sucesso por um gamaretrovírus. Deve-se monitorar visualmente para agrupamento das células após a estimulação com anti-CD3/anti-CD28. Uma falha na ativação adequada causará baixa eficiência de transdução. Também é importante monitorar a viabilidade nas células estimuladas. A baixa viabilidade após o passo de estimulação geralmente leva a uma transdução menos bem sucedida. Se as preparações do vírus são produzidas em laboratório ou terceirizadas, elas devem ser armazenadas a -80 °C em alíquotas de uso único para evitar ciclos de degelo que podem danificar o vírus e prejudicar a eficiência da transdução. O vírus deve ser usado para que quantidades consistentes de vírus possam ser usadas em cada experimento. Ao usar o vírus para transdução, descongele o vírus rapidamente e armazene no gelo até que seja necessário. A escolha de proteínas promotoras, aprimoradaras e envelopes pode impactar na eficiência da transdução e expressão de transgene nas células-alvo. Assim, um MOI deve ser empiricamente determinado. Além disso, o uso de uma mídia projetada para suportar células T e placas com poços permeáveis a gás para expansão levou a uma excelente expansão das células transduzidas. No entanto, há variabilidade animal para animal na taxa de expansão celular. Recomendamos um estudo experimental para determinar a capacidade de uma determinada preparação celular ser transduzida e expandida. Os níveis de expansão são consistentes em transduções de pequena e grande escala.
Com o uso deste protocolo, produzimos até 2,5 x 109 células para infusão em animais de teste. Embora tenhamos achado desnecessário ampliar o protocolo neste momento, o uso de 6 placas de poço é uma limitação para a preparação celular em larga escala e o protocolo exigiria modificação para produzir um maior número de células. Exemplos de modificações potenciais incluem a realização da transdução em um saco de cultura revestido com fibronectina para aumentar o número de células transduzidas e utilizar um vaso de cultura permeável a gás maior para a etapa de expansão. Embora ainda não tenhamos feito essas alterações, elas utilizam produtos disponíveis comercialmente e são modificações viáveis ao protocolo atual.
Usando este método, produzimos células transduzidas de PBMC isoladas de animais não infectados, animais infectados por SIV e de animais infectados por SIV tratados com terapia antirretroviral (TARV). No entanto, observou-se uma redução da eficiência de transdução nas células tratadas com ART20. Essa redução deve-se, presumivelmente, à inibição da transcriptase reversa e/ou integração pelas drogas. Transduções de células de animais tratados com TARV exigirão modificações neste protocolo, como a redução dos níveis intracelulares dos fármacos ART, parando a ART por vários dias antes da coleta do PBMC ou através do uso de um vetor alternativo que não é impactado pelos fármacos ART comumente utilizados.
É importante que as células produzidas para a imunoterapia sejam de um fenótipo minimamente diferenciado para que persistam após a infusão12. Embora muitos protocolos de transferência adotiva de células exijam longos tempos de cultura, um tempo de cultura ex vivo reduzido tem sido correlacionado tanto com a redução da diferenciação quanto com uma melhoria na função da célula CAR T13. O prazo relativamente rápido deste protocolo de transdução e expansão permite a manutenção do fenótipo de memória central desejado, ao mesmo tempo em que produz células suficientes para o teste de seu potencial imunoterapêutico20.
O objetivo da estratégia de produção deste produto de imunoterapia celular T é fabricar células T que reconhecerão células infectadas por SIV, trafedarão para o local de replicação viral no folículo celular B e persistirão no animal resultando em um longo prazo, resultando em um longo prazo, resultando em um longo prazo cura funcional sem necessidade de drogas anti-retrovirais. Para a tradução para um produto de imunoterapia humana, este protocolo pode ser modificado para transduzir células T humanas através do uso de anticorpos e citocinas específicos do ser humano e da implementação de padrões GMP com o objetivo final de produzir uma cura funcional para Hiv.
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi apoiado pelas subvenções do NIH 5R01AI096966-06S1 (PS, CE e EB), 1UM1AI26617 (PS, EC e EB), P51OD011106/P51RR000167 (ER), MN REACH grant 5U01HL127479-03 (PS), 1R01A1 43380-01 (PS e EB), 1UM14126617 (PS e CE), bem como fundos fornecidos pela Divisão NIAID de Pesquisa Intramural e pelo Programa Antiviral Direcionado à AIDS Intramural. Anti-CD3 e anti-CD28 utilizados nesses estudos foram fornecidos pelo NIH Nonhuman Primat Reagent Resource (R24 OD010976, U24 AI126683). O IL-2 utilizado nestes estudos foi fornecido pelo Repositório Pré-Clínico da NCI. Agradecemos aos nossos colaboradores neste projeto CD4-MBL CAR/CXCR5, Dr. Elizabeth Connick na Universidade do Arizona, Dr. Edward A Berger na NIAID, NIH, Dr. Eva G Rakasz no Centro Nacional de Pesquisa de Primatas de Wisconsin e Dr. Geoff Hart e Sra. Preethi Haran na Universidade de Minnesota, Dr. Leslie Kean na Harvard Medical School e Dr. Catherine Bollard no Children’s Research Institute. Também agradecemos ao Dr. Scott McIvor da Universidade de Minnesota, ao Dr. Christopher Peterson no Fred Hutchinson Cancer Center, ao Dr. Matthew Trivett no NIH, à Dra. Também reconhecemos com gratidão a Srta. Chi Phan e a Sra. Jhomary Alegria-Berrocal na Universidade de Minnesota pela produção gamaretroviral, e a Sra. Kim Weisgrau na Universidade de Wisconsin-Madison pelo isolamento do resus macaque PBMC.
Gammaretrovirus preparation | |||
0.025% Trypsin, 0.01% EDTA | Gibco | R-001-100 | |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
6 well plates, treated | CytoOne | CC7682-7506 | |
DMEM | Gibco | 10569-010 | |
Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | transfection reagent |
Opti-Mem | Invitrogen | 31985070 | reduced serum media |
pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | A gift from Dr. Patrick Salmon |
pMSGV1 containing CAR P2A CXCR5 | custom order from GenScript | ||
RD114 | A gift from Dr. Ed Berger | ||
T75 flasks | CytoOne | CC7682-4875 | |
VSV-G | pMD.G | A gift from Dr. Scott McIvor | |
T cell stimulation | |||
6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
Anti-CD28 | NHP Reagent Resource | Clone: CD28.2 | |
Anti-macaque CD3 | NHP Reagent Resource | Clone: FN18 | |
Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
Rhesus macaque PBMC or CD8 T cells | WNPRC | Primary cells | |
For Fibronectin coating | |||
6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
BSA (Fraction V) | HyClone | SH 30574.02 | |
RetroNectin (1 mg/ml) | TaKaRa | T100A | |
For T cell Expansion | |||
G-Rex 6 Well Plate | Wilson Wolf | P/N 80240M | Plates with gas permeable wells |
Media Components | |||
b mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
IL-2 | NCI Preclinical Repository | ||
Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
X-Vivo-15 medium | Lonza | 04-418Q | |
Variations of Media used | |||
Basic medium: | X-Vivo 15 medium, 10% heat-inactivated FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | ||
Expansion medium: | Growth medium + 50 mM b mercaptoethanol | ||
Growth medium: | Basic medium + 50 IU/ml IL-2 | Completion of media by addition of anti-CD28, IL-2 or b-mercaptoethanol should occur on the day of use. | |
Cell counting | |||
Countess cell counting chambers | Invitrogen | AMQAF1000 | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | |
Trypan blue, 0.4% solution | Invitrogen | T10282 | |
Flow Cytometry | |||
Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20186 | for conjugation of MBL antibody |
anti-CD28-BV605 | BD Biosciences | 562976 | |
anti-CD3-AF700 | BD Biosciences | 557917 | |
anti-CD4-FITC | BD Biosciences | 556615 | |
anti-CD8-BV788 | BD Biosciences | 563824 | |
anti-CD95-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 561655 | |
anti-CXCR5-PE | eBioscience | 12-1985-42 | |
anti-MBL | Invitrogen | MA1-40145-S6 | |
Flow Analysis software | FlowJo, LLC | FlowJo v10 | |
Flow Cytometer | Beckman | CytoFlex | |
Live/Dead Near IR | Invitrogen | L10119 | |
Other equipment | |||
Aerosolve canisters to contain aerosol leakage | Beckman | SX4750 | Safety equipment |
Beckman Allegra Centrifuge | Beckman | Sterilgard e3 | |
Cell culture incubator | Thermo Fisher | Everlast 247 | |
Class II Laminar flow hood | Baker | Heracell Vios 160i | |
Extra-Safe Disposable lab coat | Fisher Scientific | 359232 | Personal protective equipment |
Microplate carriers with biocertified covers | Beckman | SX4750A | Safety equipment |
Rocking platform | Benchmark | C10228 | |
Swinging bucket rotor | Beckman | X13-R | |
X-Gen Nitrile gloves | Genesee | Personal protective equipment |