Nous décrivons un protocole de 9 jours pour la transduction et l’expansion des cellules mononucléaires périphériques de sang de macaque de rhésus qui donne des cellules avec une excellente co-expression des gènes d’intérêt dans le nombre suffisant pour des études de perfusion de l’efficacité cellulaire.
Les immunothérapies émergentes pour traiter les maladies infectieuses et les cancers impliquent souvent la transduction des populations cellulaires avec des gènes codant des protéines ciblant les maladies. Par exemple, les cellules des récepteurs antigènes chimériques (RCA)-T pour traiter les cancers et les infections virales impliquent la transduction des lymphocytes T avec des gènes synthétiques codant des molécules de RCA. Les molécules de RCA font que les lymphocytes T reconnaissent et tuent spécifiquement le cancer ou les cellules infectées viralement. Les cellules peuvent également être co-transduites avec d’autres gènes d’intérêt. Par exemple, les cellules peuvent être co-transduites avec des gènes codant des protéines qui ciblent les cellules à des endroits spécifiques. Ici, nous présentons un protocole pour transduire les cellules mononucléaires périphériques primaires de sang (PBMCs) avec des gènes codant un CARDIO de protéine de maladie-spécifique et la molécule de chimiokine de molécule de chimiokine de protéine de cellules B type 5 (CXCR5). Cette procédure prend neuf jours et a comme conséquence les populations transduites de cellules T qui maintiennent un phénotype central de mémoire. L’entretien d’une mémoire centrale ou d’un phénotype moins différencié s’est associé à la persistance des cellules post-infusion. En outre, les cellules produites avec cette méthode montrent des niveaux élevés de viabilité, des niveaux élevés de co-expression des deux gènes transductés, et des quantités suffisantes de cellules pour l’infusion immunothérapeutique. Ce protocole de neuf jours peut être largement utilisé pour les cellules CAR-T et d’autres approches d’immunothérapie à cellules T. Les méthodes décrites ici sont basées sur des études présentées dans nos publications précédentes.
Les immunothérapies cellulaires apparaissent comme un nouveau moyen de traiter les maladies, y compris les cancers et les maladies infectieuses. Ces méthodes d’immunothérapie impliquent souvent la manipulation génétique des cellules thérapeutiques pour exprimer des molécules spécifiques. Par exemple, les cellules T des récepteurs d’antigène chimériques (CAR) sont conçues pour exprimer une molécule de RCA qui a un domaine extracellulaire qui lie spécifiquement les molécules sur les cellules malades et un domaine de signalisation qui déclenche les cellules immunitaires pour tuer la cellule malade. Les lymphocytes T de la RCA sont utilisés avec succès dans les immunothérapies contre le cancer et ont été particulièrement efficaces dans le traitement des leucémies à cellules B1,2,3. Des cellules CAR-T sont également en cours de développement pour traiter les infections virales telles que le VIH. Les CCR spécifiques au VIH ciblent les protéines d’enveloppe à la surface des cellules infectées viralement4. Les cellules immunothérapeutiques peuvent également être conçues pour exprimer des molécules de homing pour cibler les cellules thérapeutiques à des endroits spécifiques des tissus. Nous avons développé des vecteurs qui transduisent à la fois un CAR spécifique au virus ainsi que la molécule d’homing follicle lymphoïde CXCR55.
La réplication virale de certains virus, y compris le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) et le virus de l’immunodéficience simienne (SIV), est concentrée dans les follicules cellulaires B dans les tissus lymphoïdes secondaires6. Les follicules cellulaires B sont des sites quelque peu immunitaires privilégiés dans lesquels de faibles niveaux de CTL spécifique au virus permettent la réplication virale en cours7,8. Pour ces raisons, le ciblage des lymphocytes T spécifiques au VIH/SIV dans le follicule par l’expression de CXCR5 est une stratégie pour l’élimination du réservoir folliculaire des cellules infectées viralement9,10. Plus précisément, nous ciblons les lymphocytes T CAR spécifiques à SIV aux follicules cellulaires B par l’intermédiaire de la co-expression CXCR5.
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour transduire CAR/CXCR5 et étendre les PBMC pour produire des cellules T CAR/CXCR5 de quantités suffisantes pour l’infusion thérapeutique. Les cellules transductées avec ces méthodes maintiennent un phénotype central de mémoire. Des études ont montré que les cellules avec un phénotype moins différencié, tels que les lymphocytes T mémoire centrale et les cellules souches de mémoire T mieux persistent que les cellules plus différenciées11,12. En outre, de nombreux protocoles conçus pour produire des cellules transférées d’adoption ont des temps de culture relativement longs qui se traduisent par des cellules qui ont un phénotype plus différencié et une persistance réduite13. En outre, les cellules transférées adoptivement avec de longs temps de culture accumulés dans les poumons au lieu de cibler les tissus lymphoïdes dans le macaque rhésus14,15. Dans les méthodes que nous décrivons et démontrons ici, nous transduisons et élargissons rapidement les PBMC macaques rhésus pour produire des lymphocytes T transductés qui maintiennent un phénotype de mémoire centrale.
Les cellules T CD4 et CD8 sont incluses dans notre approche d’immunothérapie. Cette population de cellules mixtes a été choisie parce que, dans les essais cliniques, l’absence de lymphocytes T CD4MD dans le produit de cellule T CD8 a été corrélée avec un échec des lymphocytes T CD8 infusés pour persister 16. Les méthodes décrites ici commencent par activer les PBMC avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 qui stimulent puissamment le récepteur des lymphocytes T et fournissent un signal co-stimulant pour éviter l’anergie clonale17,18.
Après l’activation, les cellules sont transduites avec un vecteur gammarétroviral codant un CAR spécifique au virus et la molécule de homing lymphoïde CXCR5. Les cellules transduites sont ensuite élargies à l’aide de plaques conçues pour la propagation cellulaire non adhérente qui ont une membrane perméable au gaz à la base. Cette membrane permet l’échange de gaz au fond du puits menant à une meilleure survie cellulaire et à la disponibilité des nutriments19. À l’aide de ces méthodes, des cellules fonctionnelles suffisantes peuvent être produites dans un délai de 9 jours pour les études sur l’infusion in vivo. Bien que ce protocole soit conçu pour la transduction et l’expansion des cellules T macaques rhésus, avec une légère modification des anticorps d’activation spécifiques aux espèces, il peut être utilisé avec des cellules d’autres espèces. Ces méthodes sont basées sur nos études publiées précédemment9,20.
Ce protocole décrit une stratégie de production d’immunothérapie à cellules T qui utilise un vecteur gammarétroviral pour transduire le macaque rhésus PBMC conduisant à la population de cellules T qui exprime un RCA antiviral ainsi que le récepteur folliculaire de homing, CXCR5. Avec un total de 8 jours de temps de culture ex vivo, viables, fonctionnelles cellules T CAR sont produites dans une quantité qui est dans la gamme publiée10,21,22 utilisés pour l’infusion dans les primates non humains pour le test d’efficacité préclinique.
Le succès du protocole de transduction repose à la fois sur des PBMC sains et stimulés et sur des préparations de qualité du gammarétrovirus. Afin d’obtenir une stimulation et une transduction réussies, il est essentiel que des précautions appropriées soient prises dans le gel et le transport des PBMC après la collecte. Idéalement, si les cellules sont recueillies à l’arrêt du site, elles sont expédiées dans de l’azote liquide et rapidement placées dans un stockage d’azote liquide à long terme. Les PBMC doivent être mis en œuvre par des agents mitotically afin d’être transduire avec succès par un gammarétrovirus. Il faut surveiller visuellement le regroupement des cellules après stimulation avec l’anti-CD3/anti-CD28. Un défaut d’activation correctement entraînera une faible efficacité de la transduction. Il est également important de surveiller la viabilité des cellules stimulées. Une faible viabilité après l’étape de stimulation conduit habituellement à une transduction moins réussie. Que les préparations de virus soient produites en laboratoire ou externalisées, elles doivent être stockées à -80 oC dans des aliquots à usage unique afin d’éviter les cycles de gel du dégel qui peuvent endommager le virus et nuire à l’efficacité de la transduction. Le virus doit être titered de sorte que des quantités cohérentes de virus peuvent être utilisés dans chaque expérience. Lors de l’utilisation du virus pour la transduction, décongeler le virus rapidement et se stocker sur la glace jusqu’à ce que nécessaire. Le choix des protéines de promoteur, d’exhausteur et d’enveloppe peut tous avoir un impact sur l’efficacité de transduction et l’expression du transgène dans les cellules cibles. Ainsi, un MOI doit être déterminé empiriquement. En outre, l’utilisation d’un support conçu pour soutenir les lymphocytes T et les plaques avec des puits perméables de gaz pour l’expansion ont conduit à une excellente expansion des cellules transduites. Cependant, il y a la variabilité animale à animale dans le taux d’expansion cellulaire. Nous recommandons une étude d’essai pour déterminer la capacité d’une préparation cellulaire particulière à être transductée et élargie. Les niveaux d’expansion sont constants dans les transductions à petite et à grande échelle.
Avec l’utilisation de ce protocole, nous avons produit jusqu’à 2,5 x 109 cellules pour l’infusion dans les animaux d’essai. Bien que nous ayons trouvé inutile d’étendre le protocole à l’heure actuelle, l’utilisation de 6 plaques de puits est une limitation à la préparation cellulaire à grande échelle et le protocole nécessiterait une modification pour produire un plus grand nombre de cellules. Parmi les exemples de modifications potentielles, mentionnons l’exécution de la transduction dans un sac de culture recouvert de fibronectine afin d’augmenter le nombre de cellules transduites et d’utiliser un plus grand récipient de culture perméable pour le gaz pour l’étape d’expansion. Bien que nous n’ayons pas encore apporté ces modifications, elles utilisent des produits disponibles dans le commerce et sont des modifications réalisables au protocole actuel.
À l’aide de cette méthode, nous avons produit des cellules transduites de PBMC isolées d’animaux non infectés, d’animaux infectés par le SIV et d’animaux infectés par le SIV traités par un traitement antirétroviral (TAR). Cependant, nous avons noté une réduction de l’efficacité de transduction dans les cellules traitées par art de la multithérapie20. Cette réduction est probablement due à l’inhibition de la transcriptase inverse et / ou l’integrase par les médicaments. Les transductions de cellules d’animaux traités par ART nécessiteront des modifications à ce protocole, comme la réduction des niveaux intracellulaires des médicaments antirétroviraux en arrêtant la multithérapie pendant plusieurs jours avant la collecte du PBMC ou par l’utilisation d’un vecteur alternatif qui n’est pas affecté par les médicaments antirétroviraux couramment utilisés.
Il est important que les cellules produites pour l’immunothérapie soient d’un phénotype peu différencié afin qu’elles persistent après l’infusion12. Bien que de nombreux protocoles pour le transfert adoptif des cellules nécessitent de longs temps de culture, un temps de culture ex vivo réduit a été corrélé avec à la fois une réduction de la différenciation et une amélioration de la fonction de cellules TDE 13. Le délai relativement rapide de ce protocole de transduction et d’expansion permet le maintien du phénotype de mémoire centrale souhaité tout en produisant suffisamment de cellules pour tester leur potentiel immunothérapeutique20.
L’objectif de la stratégie de production de ce produit d’immunothérapie à cellules T est de fabriquer des lymphocytes T qui reconnaîtront les cellules infectées par le SIV, qui se répercuteront vers le site de réplication virale dans le follicule cellulaire B et qui persisteront chez l’animal, ce qui entraînera un long terme traitement fonctionnel sans avoir besoin de médicaments antirétroviraux. Pour la traduction vers un produit d’immunothérapie humaine, ce protocole peut être modifié pour transduire les lymphocytes T humains grâce à l’utilisation d’anticorps et de cytokines spécifiques à l’homme et à la mise en œuvre de normes GMP dans le but ultime de produire un traitement fonctionnel pour Vih.
The authors have nothing to disclose.
Cette étude a été soutenue par les subventions des NIH 5R01AI0969666-06S1 (PS, EC et EB), 1UM1AI26617 (PS, EC et EB), P51OD011106/P51RR000167 (ER), MN REACH grant 5U01HL127479-03 (PS), 1R01A143380-01 (PS et EB), 1UM14126617 (PS et EC) ainsi que les fonds fournis par la Division niSAID de la recherche intra-muros et le Programme antiviral ciblé sur le sida intra-muros des NIH. Anti-CD3 et anti-CD28 utilisés dans ces études a été fourni par le NIH Nonhuman Primate Reagent Resource (R24 OD010976, U24 AI126683). L’IL-2 utilisé dans ces études a été fourni par le dépôt préclinique NCI. Nous remercions nos collaborateurs dans ce projet CD4-MBL CAR/CXCR5, la Dre Elizabeth Connick à l’Université de l’Arizona, le Dr Edward A Berger au NIAID, les NIH, la Dre Eva G Rakasz au Wisconsin National Primate Research Center et le Dr Geoff Hart et Mme Preethi Haran à l’Université du Minnesota, le Dr Leslie Kean à la Harvard Medical School et la Dre Catherine Bollard à l’Institut de recherche pour enfants. Nous remercions également le Dr Scott McIvor de l’Université du Minnesota, le Dr Christopher Peterson au Fred Hutchinson Cancer Center, le Dr Matthew Trivett aux NIH, le Dr Agne Taraseviciute à l’Hôpital pour enfants de Seattle et le Dr Conrad Russell Cruz du Children’s Research Institute pour leur aide très utile pour optimiser ce protocole. Nous remercions également Mme Chi Phan et Mme Jhomary Alegria-Berrocal de l’Université du Minnesota pour la production gammarétrovirale, et Mme Kim Weisgrau, de l’Université du Wisconsin-Madison, pour l’isolement du macaque rhésus PBMC.
Gammaretrovirus preparation | |||
0.025% Trypsin, 0.01% EDTA | Gibco | R-001-100 | |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
6 well plates, treated | CytoOne | CC7682-7506 | |
DMEM | Gibco | 10569-010 | |
Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | transfection reagent |
Opti-Mem | Invitrogen | 31985070 | reduced serum media |
pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | A gift from Dr. Patrick Salmon |
pMSGV1 containing CAR P2A CXCR5 | custom order from GenScript | ||
RD114 | A gift from Dr. Ed Berger | ||
T75 flasks | CytoOne | CC7682-4875 | |
VSV-G | pMD.G | A gift from Dr. Scott McIvor | |
T cell stimulation | |||
6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
Anti-CD28 | NHP Reagent Resource | Clone: CD28.2 | |
Anti-macaque CD3 | NHP Reagent Resource | Clone: FN18 | |
Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
Rhesus macaque PBMC or CD8 T cells | WNPRC | Primary cells | |
For Fibronectin coating | |||
6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
BSA (Fraction V) | HyClone | SH 30574.02 | |
RetroNectin (1 mg/ml) | TaKaRa | T100A | |
For T cell Expansion | |||
G-Rex 6 Well Plate | Wilson Wolf | P/N 80240M | Plates with gas permeable wells |
Media Components | |||
b mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
IL-2 | NCI Preclinical Repository | ||
Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
X-Vivo-15 medium | Lonza | 04-418Q | |
Variations of Media used | |||
Basic medium: | X-Vivo 15 medium, 10% heat-inactivated FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | ||
Expansion medium: | Growth medium + 50 mM b mercaptoethanol | ||
Growth medium: | Basic medium + 50 IU/ml IL-2 | Completion of media by addition of anti-CD28, IL-2 or b-mercaptoethanol should occur on the day of use. | |
Cell counting | |||
Countess cell counting chambers | Invitrogen | AMQAF1000 | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | |
Trypan blue, 0.4% solution | Invitrogen | T10282 | |
Flow Cytometry | |||
Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20186 | for conjugation of MBL antibody |
anti-CD28-BV605 | BD Biosciences | 562976 | |
anti-CD3-AF700 | BD Biosciences | 557917 | |
anti-CD4-FITC | BD Biosciences | 556615 | |
anti-CD8-BV788 | BD Biosciences | 563824 | |
anti-CD95-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 561655 | |
anti-CXCR5-PE | eBioscience | 12-1985-42 | |
anti-MBL | Invitrogen | MA1-40145-S6 | |
Flow Analysis software | FlowJo, LLC | FlowJo v10 | |
Flow Cytometer | Beckman | CytoFlex | |
Live/Dead Near IR | Invitrogen | L10119 | |
Other equipment | |||
Aerosolve canisters to contain aerosol leakage | Beckman | SX4750 | Safety equipment |
Beckman Allegra Centrifuge | Beckman | Sterilgard e3 | |
Cell culture incubator | Thermo Fisher | Everlast 247 | |
Class II Laminar flow hood | Baker | Heracell Vios 160i | |
Extra-Safe Disposable lab coat | Fisher Scientific | 359232 | Personal protective equipment |
Microplate carriers with biocertified covers | Beckman | SX4750A | Safety equipment |
Rocking platform | Benchmark | C10228 | |
Swinging bucket rotor | Beckman | X13-R | |
X-Gen Nitrile gloves | Genesee | Personal protective equipment |