中央記憶表現型の維持による9日間の主要T細胞の導入と拡張

注: このアカシスPBMCトランスダクションプロトコルは、ガンマレトロウイルスベクターの使用を必要とします。ガンマレトロウイルスは、ラボで生産するか、ウイルス生産会社に委託できることに注意してください。実験室での生産はステップ1で概説されたプロトコルで行うことができるし、ウイルスはステップ2で概説されるようにしがみつくことができる。ウイルスが現場で生成されるか、制作会社によって産生されるかに関わらず、MOI(培養中の細胞に対する感染性ビリオンの比率)は、ステップ3で概説されているように、新たに産生されたウイルス製剤および対象細胞ごとに決定されるべきである。 注意:ガンマレトロウイルスベクターまたは他のレトロウイルスベクターを使用するには、ラボコートや手袋の二重層の使用などの適切な安全対策が必要です。ウイルスのすべての取り扱いは、バイオセーフティフードで発生する必要があります。すべてのピペットは、30分間10%漂白剤の溶液中で除染する必要があります。すべての液体感染性廃棄物は、10%漂白剤の最終濃度で除染する必要があります。微生物学的エアロゾルの放出を防ぐシールを備えた二次封じ込めは、遠心分離のために必要とされる 1. ガンマレトロウイルスストックの製造 トランスフェクション用プレート293T細胞。完全なウイルス製剤は、抗生物質なしでダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)+10%胎児ウシ血清(FBS)で4.5 x 106細胞/フラスコで12 T75フラスコを必要とします。 細胞がトランスフェクションの前に37°Cで一晩成長するようにします。 1.5 mL減らされた血清培地で60μLのトランスフェクション試薬を希釈した。フラスコごとにチューブを1つ用意します。RTで5分間インキュベートします。 フラスコごとに、1.5 mLの減らされた血清培地と以下のプラスミドを含むチューブを準備します:目的の遺伝子を含む転写プラスミドの9.0 μg、RD114の3 μgおよびVSV-G(エンベローププラスミド)の1.2 μg、および3 μgのギャグ/pol g。注:エンベロープおよびgag/pol遺伝子は、レトロウイルス包装に必要です。当社のレトロウイルス生産のために、RD114エンベロープと、安定性を加えるため、少量のVSV-Gエンベロープを追加しました。 希釈したプラスミド(ステップ1.4)を希釈トランスフェクション試薬に加える(ステップ1.3)。やさしく混ぜます。室温で20分間インキュベートします。 細胞5 mLの新鮮な完全な培地を供給し、3 mLのトランスフェクション試薬/プラスミド混合物を1フラスコあたり滴下し、37°Cで5〜6時間インキュベートする。 フラスコにさらに5mLの新鮮な培地を加え、37°Cで42〜43時間インキュベートします。 48時間の総トランスフェクション時間の後、培地と遠心分離機を4°Cで3分間1282 x gで回収し、細胞の破片を除去します。 アリコートは将来の使用のために適切な量に、フラッシュはエタノール/ドライアイス浴でウイルスを凍結し、-80 °Cで保存します。 2. ガンマレトロウイルスのタテリング 注: 有効な価数を得るためには、いくつかの希釈ウイルスが必要になる場合があります。 6ウェルプレートに600,000個の細胞/ウェルで293T細胞をプレートし、37°Cで24時間プレートをインキュベートします。 細胞から培地を取り出し、293T(2 mLのウイルスの総量)に所望の量のDMEM + 10Sを加えます。 対応する井戸にウイルスを追加し、混合するために穏やかに渦巻きます。例えば、200 μL、100 μL、50 μL、25 μL をそれぞれ 4 つのウェルに加えます。フローサイトメトリー(模擬サンプル)のためのウイルスのないウェルを含める。 37°Cで48時間インキュベートする。 トリプシン-EDTAを0.5 mL添加し、37°Cで4分間インキュベートすることにより、293T細胞をトリプシン化します。DMEM + 10% FBSの1.5 mLを加えてトリプシンを停止します。細胞を数え、自動化された細胞カウンターまたはヘモサイトメーターで生存率を決定する。 セルカウンターを使用するには、10 μLのセルをトリパンブルーの10 μLに加え、混合し、チャンバースライドをロードし、カウンターに挿入します。「キャプチャ」ボタンを押してセルをカウントします。 0.5~1 x 106個のセルを収集し、フローサイトメトリーでCARおよびCXCR5のレベルを評価します(ステップ9.5を参照)。CXCR5と共にCD4またはMBLを発現させることで、CARおよびCXCR5とを併発現させる293T細胞を同定する。ステップ9.5.1の反応性抗体を参照してください。 ウイルス性の高い抗剤を計算します。注: 価数の計算には、トランスダクション レベルが 20% 以下のサンプルを選択します。 次の数式を使用して、タンターを計算します。トランスダクション単位/mL =(培養中の細胞数)(細胞の割合)/培養に添加されたウイルスの量 3. 新たに産生されたウイルス製剤と細胞の最適なMOIの決定 一次PBMCsとガンマレトロウイルス製剤の二重希釈を用いたトランスダクションプロトコル(セクション4~9)に従ってください。 フローサイトメトリーにより対象遺伝子の発現レベルを評価する(ステップ9.5)。 細胞生存率を失うことなく最大の伝達を可能にするウイルスの濃度を選択してください。 4. 抗CD3抗体を用いてウェルをコーティングすることによりT細胞活性化のためのプレートを準備する リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でストックを10 μg/mLに希釈して、抗マカクCD3抗体(FN18)を調製します。 6ウェルプレートに2 mL/ウェルを分配します。37°Cで2時間インキュベートする代わりに、プレートを4°Cで一晩インキュベートすることができる。 PBSおよび非結合抗体を吸引する。2 mLのPBSでウェルを2回リンスし、すぐにPBMCsをプレートに使用します。 5. プレート結合抗CD3および可溶性抗CD28によるアゲサスPBMCsの刺激 少量の氷が残るまで、穏やかな攪拌で、37°Cの水浴で一次アカゲ座を解凍します。 フード内で、ピペット細胞を円錐形のチューブにそっと入れ入れ。塩基性培地1mLでバイアルをすすい、ゆっくりと細胞に加えます。次に、細胞に9mLの温かい塩基性培地をゆっくりと加えます。注:このステップはスケールアップできますが、一度に4バイアル以上を解凍することはありません。 22°Cで5分間600xgで遠心分離機を細胞にペレットする。 g上清を吸引し、少量の成長培地でペレットを再懸濁する。最終的な濃度は2 x 106細胞/mLでなければならないので、この時点で細胞の濃度が2 x 106細胞/mLを超えるような体積を選択してください。 細胞をトリパンブルーで染色し、その細胞を数えて生存細胞の数を決定します。注:これは標準的なヘモサイトメーターまたは自動化された細胞のカウンターで行うことができる。生細胞の生存率と数を表示する自動セルカウンターを使用しています。 カウンターを使用するには、10 μLのセルを10 μLのトリパンブルーに加え、混合し、チャンバースライドをロードしてカウンターに挿入します。「キャプチャ」ボタンを押してセルをカウントします。 細胞濃度を体積で乗算して細胞の総数を計算し、増殖培地で細胞を2 x 106細胞/mLに希釈します。めっきする前に、T細胞活性化に必要な共刺激信号を提供するために、5 μg/mLの最終濃度に抗CD28を加えます。 ピペット細胞を抗CD3コーティングプレートに。ウェルあたり3〜6 x 10個のセルを加え(良好なターゲットはウェルあたり2 mL培地で4 x 106細胞)、5%CO2で37 °Cで2日間インキュベートする。2 6. フィブロネクチンコーティングプレートの準備 注:PBMCおよびT細胞は、インテグリン受容体VLA-4またはVLA-5を発現し、フィブロネクチン媒介伝達の良い標的である。 プレートをコーティングする前に、まず滅菌PBSで1:100に希釈してフィブロネクチン試薬を調製する。 6ウェルプレートの各ウェルに滅菌フィブロネクチン溶液のピペット2mL。室温で2時間軽く揺らすプレート。注: 非処理、細胞培養グレードの組織培養プレートまたは皿は、このステップで使用する必要があります。 フィブロネクチン溶液を吸引により除去し、次いでPBS中の滅菌2%ウシ血清アルブミン(BSA、フラクションV)の1mLでブロックする。プレートを室温で30分間揺らします。 BSA溶液を吸引し、2mLのPBSでプレートを洗浄します。PBSの吸引後、フィブロネクチンコーティングされたプレートをシールラップで密封し、4°Cで最大1週間保存することができます。注:私たちは通常、導入の1日前にプレートを準備します。 7. 活性化されたアキサスPbMCの導入 注意:ウイルスベクターまたはアカゲザルPBMCsで作業するには、ラボコートや手袋の二重層の使用などの適切な安全対策の利用が必要です。ウイルスおよび細胞のすべての取り扱いは、バイオセーフティフードで発生する必要があります。すべてのピペットは、30分間10%漂白剤の溶液中で除染する必要があります。すべての液体感染性廃棄物は、10%漂白剤の最終濃度で除染する必要があります。微生物学的エアロゾルの放出を防止するシールを有する二次封入は、遠心分離のために必要とされる。 フィブロネクチンコーティングウェルにガンマレトロウイルストランスデューシングベクターを取り付けます。 2000 x gで約 30 分間走って、遠心分離機を 32 °C に温める。 37°Cの水浴で、無血清および成長培地の両方を温めます。 氷上でウイルスを解凍するか、少量の氷が残るまで37°Cの水浴でバイアルを穏やかに渦巻くことによって解凍します。ウイルス製剤の劣化を避けるために、内容物をウォームアップしないようにしてください。 レトロウイルスを、血清フリー培地で所定の最適な感染多重度(MOI)に希釈する。注:私たちのガンマレトロウイルスとアカゲスPBMCでは、0.5のMOIが最適であることがわかりました。 希釈例: 4つのウェルをウイルスでコーティングし、1.5 x 106細胞を追加するには、(4)(1.5 x 10 6)(0.5)=3 x 106 TUが必要です。6ウイルス用のチターが1.1 TU/mLの場合は、5.3 mLメディアで2.7 mLウイルスを使用して、合計容量8mLを使用します。 フィブロネクチンコーティングされたプレートの各ウェルに2mL希釈レトロウイルスを加えます。 陰性対照の模擬導入細胞の場合、フィブロネクチンコーティングされたウェルに単独で培地を添加する。 あらかじめ温めた32°C遠心分離機に、バイオセーフカバーと遠心分離機を2000 x gでマイクロプレートキャリアに入れ、2時間置きます。注:ウイルスコーティングされたプレートは、一晩4°Cで、ウイルスと一緒に、すぐにまたは保存することができます。 即時使用のために、ウイルス製剤をウェルから吸引し、2mLの成長培地を加える。ウイルスコーティングされた井戸を乾燥しないようにしてください。 刺激されたPBMCをプレートします。 逆顕微鏡を使って細胞を確認します。細胞は健康に見えるはずです, 彼らはラウンドであることを意味します, 明るく、光を屈折.彼らはまた、刺激を示す凝集した外観を示す必要があります。 標的細胞を収集し、50 mL円錐管に移します。1 mL成長培地でウェルを1回リンスし、円錐管に加えます。手順 5.4 のように、自動セル カウンターを持つ生細胞の数をカウントします。注: 刺激された細胞は凝集し、この凝集は正確に細胞を数えるのが困難につながる可能性があります。 32°Cで5分間600xgで遠心分離してチューブg中の細胞をペレットにする。培地を細胞ペレットから吸引し、1.5 x 106細胞/mLの濃度で増殖培地中の細胞を再懸濁させた。 各ウイルスコーティングウェル(ステップ7.1で調製)に、合計1.5 x 106細胞/3 mLの細胞懸濁液を1mL加える。各ウェルには既に2 mL成長培地が含まれていることに注意してください。モックトランスデューセド細胞についても同じ手順を実行しますが、ウイルスを受け取らなかったフィブロネクチンコーティングされたウェルにプレートします。 プレートを1000 x gで32°Cで10分間遠心します。 5%CO2の下で37°Cで48時間プレートをイン2キュベートします。 8. 細胞の転移 細胞を再懸濁させるために5 mLピペットでウェルの内容物を上下に描き、50 mL円錐形チューブに移します。 各ウェルに1 mLの成長培地を加え、無菌転写ピペットで上下に引き出し、接着細胞を除去します。 ステップ 5.4 のように、セル数のカウントを行い、自動化されたセルカウンターを使用してセルの合計数と生存率を決定します。 必要に応じて、フローサイトメトリー用に1 x106細胞を除去し、遺伝子発現および表現型を評価する。推奨される抗体および格言戦略については、ステップ 9.5.1 および材料表を参照してください。 600 x gで細胞を 25 °C で 10 分間遠心分離します。 培地を吸引し、1 x 106細胞/mLの濃度に膨張培地中の細胞を再懸濁します。6-ウェルプレートの各ガス透過ウェルに5 mLの細胞をシードします。井戸ごとに25mLの拡張メディアを慎重に重ねてください。注: 小さなボリュームにセルを追加し、残りのメディアを重ねて、セルがウェルの底部に残るようにします。 5%CO2インキュベーターで37°Cで4日間2培養を行います。 9. 細胞の拡大と、細胞のトランスデューシングの表現型の評価 20 mLの媒体を取り除き、廃棄することによってガス透過性の井戸から細胞を集める。細胞を乱さないように注意する必要があります。.注: セルを 4 日間だけ展開し、この時点でセルを収集します。しかし、追加の日数の培養が望ましい場合は、細胞を乱さずに20mLの培地を取り除き、20mLの新鮮な膨張培地に交換してください。 残りのメディアを上下にピレットして、セルを取り外します。細胞がうまく成長している場合、メディアは非常に曇っているはずです。 滅菌移動ピペットを使用して、3 mL培地で各ウェルをリンスし、残留細胞を収集します。 自動カウンタまたはヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、生存率と細胞数を確認します。 細胞細胞量測定の流れを行い、細胞表現型とトランスデューセド遺伝子発現を決定する。 この例では、CD4(M-T477)に対する抗体を用いてアカゲザルPBMC表現型を決定し、内因性rhCD4およびrhCD4-MBL CARの両方で反応性を有するクローンである。合計T細胞とCD8 T細胞をそれぞれ染色するCD3(SP34-2)およびCD8(RPA-T8)に対して;細胞の記憶表現型を決定するために使用される死受容体CD95(DX2)と共刺激分子CD28(CD28.2)に対して;CXCR5(MU5UBEE)およびMBL(3E7)に対して、トランスデューセドセル上のCXCR5およびCD4-MBL CARを検出する。 生存率を評価し、固定可能な生存性染料で評価した。 フローサイトメトリー用の細胞を準備します。 チューブの総数の抗体マスターミックスを構成します。PBS を使用して、合計ボリュームまで持ち出します。 フローチューブにセルを追加します。チューブあたり 0.5 ~ 1 x 106 個のセルを配置します。染色されていない細胞や、染色された模擬導入細胞などの陰性コントロールを含む。 細胞にPBSの2mLを加え、400 x gで遠心分離機を室温(RT)で5分間加え、デカントします。 100 μLの抗体ミックスをチューブに加え、RTで30分間インキュベートします。 PBS 2 mL を加え、遠心分離機を 400 x gで 5 分間 RT とデカントで加えます。 300 μLのパラホルムアルデヒドを1%添加し、15分間インキュベートします。 400 x gでの遠心分離機 RT とデカンで 5 分間。300 μLのPBSを加え、混ぜます。 フローサイトメーターで、各サンプルに対して150,000個のイベントを取得します。 フロー解析ソフトウェアを使用してデータを分析します。注: 格言戦略は以前に公開されました20. トランスデューセド細胞の同定のために、リンパ球、シングル、ライブ、CD3+、およびMBL+CXCR5+上のゲート細胞。 中央記憶集団の同定のために、リンパ球上のゲート細胞、シングルト、生CD3+、CD8+、CD28+CD95+。 必要に応じてセルを使用します。細胞は、トランスウェル移行アッセイ9またはインビトロ細胞殺死アッセイ55,99などのインビトロの機能アッセイに使用することができる。細胞は動物への注入に使用することができる。あるいは、残りの細胞を90Sで10%ジメチルスルホキシド(DMSO)で凍結し、後で使用または分析する注:アカゲザルへの養子移送細胞の注入の標的用量はまだ確立されていませんが、非ヒト霊長類の導入導入研究は0.6〜1.2 x 107セル/kg 21、1〜5 x21108細胞/kg 22、1.4〜8 x 108細胞/kg22 10を使用しています。この範囲をガイドラインとして、この9日間のプロトコルで注入のための十分な細胞を作り出すことができる。