התמרה והרחבה של תאי T ראשוניים בתשעה ימים עם אחזקה של זיכרון מרכזי מושגים

הערה: פרוטוקול התמרה רזוס של PBMC זה מחייב שימוש בווקטור של הגמרואטנגיזציה. שימו לב כי ניתן לייצר וירוס gammaretrovirus במעבדה או מיקור חוץ לחברת הפקה נגיפית. בייצור מעבדה ניתן לבצע עם הפרוטוקול המתואר בשלב 1 והווירוס ניתן לבצע כמתואר בשלב 2. אם הנגיף מופק באתר או על-ידי חברת הפקה, יש לקבוע את משרד היחסי (יחס של הריטונים הזיהומיות לתאים בתרבות), כפי שמתואר בשלב 3, עבור כל הכנה ויראלית שנוצרה לאחרונה ותאי הריבית. התראה: עבודה עם וקטורים וקטורים מסוג הגמאראטריליים או כלים אחרים מחייבים אמצעי זהירות נאותים כגון שימוש במעילים מעבדה ושכבות כפולות של כפפות. כל הטיפול בווירוס חייב להתרחש במכסה הביובטיאל. כל הdecontaminated צריך להיות בתמיסה של 10% אקונומיקה עבור 30 דקות. יש לdecontaminated את כל הפסולת הזיהומית הנוזלית בריכוז הסופי של 10% אקונומיקה. בלימה משנית, עם חותם המונע שחרור של אירוסולים מיקרוביולוגית, נדרש עבור צנטריפוגה 1. הפקת מניות הגממראטנגיל הצלחת 293T תאים לזיהום. הכנה וירוס מלא דורש 12 T75 מבחנות ב 4.5 x 106 תאים/בקבוקון ב שונה מדיום הנשר בינונית (dmem) + 10% סרום עוברי (fbs) ללא אנטיביוטיקה. אפשר לתאים לצמוח לילה ב 37 ° צ’ לפני החצייה. לדלל 60 μL של הזיהום מגיב ב 1.5 mL מופחתת סרום מופחת. הכן צינורית אחת לכל בקבוקון. מודטה למשך 5 דקות ב RT. עבור כל בקבוקון, להכין צינור המכיל 1.5 mL של מדיה סרום מופחת ואת הפלמידים הבאים: 9.0 μg של העברת הפלסטיק המכיל את הגן (s) של עניין, 3 μg של RD114 ו 1.2 μg של VSV-G (פלמידים המעטפה), ו 3 μg של מחסום-פה/פול.הערה: המעטפה ו-לחסום/פול גנים נחוצים עבור האריזה retroviral יעיל. עבור הייצור הרטרונגיפי שלנו, אנו מוסיפים הן את המעטפה RD114, עבור הוסיף יציבות, כמות קטנה של מעטפת VSV-G. הוסף פלמידים מדולל (שלב 1.4) כדי מדולל בזיהום החצייה (שלב 1.3). מערבבים בעדינות. דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר. להאכיל את התאים 5 מ ל של מדיה מלאה טרי ולהוסיף 3 מ ל של החוצה הזרע מגיב/בינוני בתערובת בקבוקון לבקבוקון ו דגירה עבור 5 – 6 h ב 37 ° c. הוסף 5 מ ל נוסף של בינוני טרי כדי מבחנות ו דגירה עבור 42 – 43 h ב 37 ° c. לאחר זמן החצייה הכולל של 48 h, לאסוף מדיה צנטריפוגה ב 1282 x g עבור 3 דקות ב 4 ° צ’ כדי להסיר פסולת תא. הבהוב לתוך אמצעי אחסון מתאימים לשימוש עתידי, הקפאת הווירוס באמבט אתנול/קרח יבש והחנות ב-80 ° c. 2. לאחד את הווירוס Gammar, וירוס הערה: מספר מדלל של וירוס עשוי להיות צורך להשיג titer תקף. צלחת 293T תאים ב 600,000 תאים/גם בצלחת 6-באר ו מודקת את הצלחות עבור 24 h ב 37 ° c. הסר את המדיום מן התאים והוסף את הסכום הרצוי של Dמאמ + 10% FBS ל 293T (2 mL נפח כולל של וירוס). להוסיף את הווירוס המתאים היטב מערבולת בעדינות לערבב. לדוגמה, הוסף 200 μL, 100 μL, 50 μL ו-25 μL בהתאמה ל-4 בארות. כלול גם היטב ללא וירוסים עבור cy, לדוגמה מדגם). מודטה עבור 48 h ב 37 ° c. טריזיסיזציה של התאים 293T על ידי הוספת 0.5 mL של טריפסין-EDTA ו הדגירה 4 דקות ב 37 ° c. הפסיקו את הטריפסין על-ידי הוספת 1.5 mL של Dמאמ + 10% FBS. ספור את התאים וקבע את הכדאיות באמצעות מונה תאים אוטומטי או הומוציטומטר. כדי להשתמש במונה התאים, הוסף 10 μL של תאים עד 10 μL של טרימין כחול, ערבב, טען את השקופית הקאמרית והכנס לתוך המונה. ללחוץ על כפתור “ללכוד” כדי לספור את התאים. לאסוף 0.5 – 1 x 106 תאים ולהעריך רמות של רכב CXCR5 ידי הזרמת cy, לראות (ראה שלב 9.5). ביטוי של CD4 או MBL יחד עם CXCR5 יזהה התמרה 293T t לבטא את המכונית ואת CXCR5. ראה נוגדנים ראקטיבית בשלב 9.5.1. חישוב titer נגיפי.הערה: בחר את המדגם ברמת התמרה של 20% או פחות לחישוב titer. השתמש בנוסחה הבאה לחישוב titer:יחידות התמרה/mL = (מספר התאים בתרבות) (% של תאים שעברו התמרה)/נפח של וירוס שנוסף לתרבות 3. קביעת משרד המידע האופטימלי עבור הכנה ויראלית שיוצרו לאחרונה ותאי העניין בצע את פרוטוקול התמרה (סעיפים 4 – 9) עם PBMCs הראשי וכפולה של הכנה מגמאראטנגיזציה. להעריך את רמת הביטוי של הגנים של העניין על ידי הזרימה cy, (שלב 9.5). בחר ריכוז של וירוס המאפשר התמרה מקסימלית ללא אובדן הכדאיות של התא. 4. הכנת צלחות להפעלת תא T על ידי ציפוי וולס עם נוגדנים נגד CD3 הכנת נוגדן CD3 נגד מקוק (FN18) על ידי דילול המניה כדי 10 μg/mL ב פוספט מאגר מלוחים (PBS). מדבקות 2 מ ל/ובכן ב 6-צלחות. המלון משלב בין השאר ב37 ° c עבור 2 מעלות לחילופין. . והנוגדנים הלא מאוגדים לשטוף בארות פעמיים עם 2 מ ל של PBS ולהשתמש מיד לוחית PBMCs. 5. עירור רזוס PBMCs עם צלחת מאוגד Anti-CD3 ו מסיסים Anti-CD28 הפשרת רזוס PBMCs העיקרי באמבט מים בגובה 37 ° c, עם עצבנות עדינה, עד שנותר רק כמות קטנה של קרח. במכסה המנוע, בעדינות מנקז. תאים לתוך צינור חרוט לשטוף את המבחנה עם 1 מ ל של בינונית בסיסית ולהוסיף אותו לאט לתאים. לאחר מכן, לאט להוסיף 9 מ ל נוסף של בינונית בסיסית חמה לתאים.הערה: ניתן לשנות שלב זה, אך לעולם לא להפשיר יותר מ-4 מבחנות בו. צנטריפוגה ב 600 x g עבור 5 דקות ב 22 ° c כדי לצנפה את התאים. ולאחר מכן השהה מחדש את הגלולה. בכמות קטנה של מדיום גדילה בחר אמצעי אחסון כזה שריכוז התאים יעלה על 2 x 106 תאים/mL בשלב זה מאז הריכוז הסופי צריך להיות 2 x 106 תאים/mL. כתמים תאים עם טרי, כחול ולספור את התאים כדי לקבוע את מספר תאים קיימא.הערה: ניתן לעשות זאת באמצעות הומוציטוטומטר סטנדרטי או מונה תאים אוטומטי. אנו משתמשים בדלפק תאים אוטומטי המציג את הכדאיות ואת מספר התאים החיים. כדי להשתמש במונה, להוסיף 10 μL של תאים כדי 10 μL כחול, לערבב, לטעון את שקופית קאמרית ולהכניס לתוך הדלפק. ללחוץ על כפתור “ללכוד” כדי לספור את התאים. חשב את המספר הכולל של תאים על-ידי הכפלת ריכוז התא באמצעות נפח ולאחר מכן דלל את התאים ל-2 x 106 תאים/mL במדיום גדילה. לפני ציפוי, להוסיף anti-CD28 לריכוז הסופי של 5 μg/mL על מנת לספק אות מגירוי שיתוף הכרחי עבור הפעלת התא T. תאים פיפטה לתוך לוחות מצופים אנטי CD3. הוסף 3 – 6 x 106 תאים לכל טוב (המטרה הטובה היא 4 x 106 תאים ב 2 מ”ל מדיה לכל טוב) ו דגירה עבור 2 ימים ב 37 ° c ב 5% CO2. 6. הכנת לוחות מצופים בפיסמטין הערה: PBMC ו-T תאים לבטא אינטגרציה קולטנים ויולה-4 או ויולה-5 והם מטרות טובות עבור התמרה בתיווך fibronectin. לפני ציפוי לוחיות, ראשית להכין fibronectin מגיב על ידי דילול זה 1:100 ב-PBS סטרילי. פיפטה 2 מ ל של התמיסה הסטרילית של fibronectin לתוך כל טוב של צלחת 6-היטב. לוחות סלע בעדינות עבור 2 h בטמפרטורת החדר.הערה: בשלב זה יש להשתמש בכלים שאינם מטופלים, לוחיות התרבות של רקמת התאים או מנות שאינן מטופלות. הסר את הפתרון fibronectin על ידי שאיפה ולאחר מכן לחסום עם 1 מ ל של סטרילי 2% סרום שור בקר (BSA, שבר V) ב-PBS. מטלטל את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. מטפי את פתרון BSA ולשטוף את הצלחת עם 2 מ ל של PBS. לאחר השאיפה של ה-PBS, ניתן לאטום את הלוחות המגולפות בציפוי האטום בעטיפת החותם ולאחסנו ב -4 ° c עד שבוע.הערה: אנו בדרך כלל מכינים את הצלחות יום אחד לפני התמרה. 7. התמרה של הרזוס מופעל PBMCs התראה: עבודה עם וקטורים ויראליות או עם PBMCs רזוס מקוק דורש ניצול של אמצעי זהירות נאותים כגון שימוש במעילים מעבדה ושכבות כפולות של כפפות. כל הטיפול בווירוס והתאים חייבים להתרחש במכסה הביובטיטיאלי. כל הdecontaminated צריך להיות בתמיסה של 10% אקונומיקה עבור 30 דקות. יש לdecontaminated את כל הפסולת הזיהומית הנוזלית בריכוז הסופי של 10% אקונומיקה. בלימה משנית עם חותם המונע שחרור של אירוסולים מיקרוביולוגית, נדרש עבור צנטריפוגה. הצמד את וקטור הגמרואטריקציה לציפוי היטב. לחמם צנטריפוגה 32 ° צ’ על ידי ריצה ב 2000 x g כ 30 דקות. חמם גם את הסרום מדיה חופשית וצמיחה באמבט מים ב37 ° c. הפשרת הווירוס על הקרח או על ידי מתערבל בעדינות במבחנה באמבט מים 37 ° c עד כמות קטנה של קרח בלבד. כדי להימנע מהשפלה של ההכנה הנגיפית, אל תאפשר לתכנים להתחמם. דלל את הרטרו וירוס לריבוי מוגדר מראש של זיהום (מוי) במדיום ללא סרום.הערה: עם וירוס gammar, שלנו רזוס PBMC, גילינו כי משרד ה0.5 הוא אופטימלי. דילול לדוגמה: לחלוק 4 בארות עם וירוס ולהוסיף 1.5 x 106 תאים, (4) (1.5 x 106) (0.5) = 3 x 106 TU נדרשים. אם סיכוייו נגיפי הוא 1.1 TU/mL, לאחר מכן להשתמש 2.7 ml וירוס ב 5.3 ml מדיה עבור נפח כולל של 8 ml. הוסף 2 mL מדולל רטרווירוס לכל טוב של הצלחת מצופה fibronectin. עבור שליטה שלילית בתאי התמרה, הוסף מדיה בלבד לבארות הציפוי המצופה. מניחים את לוחיות בתוך מחומם מראש 32 ° c צנטריפוגה בנשאים אימונולוגיה עם כיסויים סטרילית ו צנטריפוגה ב 2000 x g עבור 2 h.הערה: לוחות מצופים וירוס ניתן להשתמש באופן מיידי או מאוחסן, עם וירוס, ב 4 ° c ללילה. לשימוש מיידי, מנושף את הכנת הווירוס מבארות ומוסיפים 2 מ ל של מדיום גדילה. שמור על בארות מצופי וירוסים מפני ייבוש. . לוחית הגירוי בדוק את התאים בעזרת מיקרוסקופ הפוך. התאים צריכים להיראות בריאים, כלומר הם עגולים, בהירים ושבירה אור. הם צריכים גם להראות מראה מרומז המעיד על גירוי. לאסוף את התאים היעד ולהעבירם לשפופרת חרוט 50 mL. לשטוף את הטוב פעם אחת עם מדיה גדילה 1 mL ולהוסיף צינור חרוט. לספור את מספר התאים החיים עם מונה התא האוטומטי כמו בשלב 5.4.הערה: התאים הממריצים יהיו מצופפים והאפשרות הזאת עלולה לגרום לקשיים בספירת התאים באופן מדויק. גלולה את התאים בצינורות ידי תפרידו ב 600 x g עבור 5 דקות ב 32 ° c. מריף את התקשורת מתוך הגלולה תא ולהשעות מחדש את התאים בינוני גדילה בריכוז של 1.5 x 106 תאים/mL. לכל וירוס מצופה היטב (מוכן בשלב 7.1) להוסיף 1 mL של הבולם הנייד עבור סך של 1.5 x 106 תאים/3 mL. שים לב כי כל טוב כבר מכיל 2 mL בינונית צמיחה. לבצע את השלבים אותם עבור תאים מדומה, אבל לוחית אותם על הבארות מצופה fibronectin אשר לא קיבל וירוס. צנטריפוגה את הצלחות ב 1000 x g עבור 10 דקות ב 32 ° c. מודטה את הצלחות עבור 48 h ב 37 ° צ’ תחת 5% CO2. 8. הרחבת התאים המתמרים לצייר את התוכן של הבארות למעלה ולמטה עם 5 מ ל pipet כדי להשעות את התאים ולאחר מכן לעבור לשפופרת חרוט 50 mL. להוסיף 1 מ ל של מדיית הצמיחה לכל טוב לצייר למעלה ולמטה עם pipet העברה סטרילית להסיר תאים חסיד. ספירת תאים כדי לקבוע את מספר התאים והכדאיות הכוללת באמצעות מונה תאים אוטומטי כמו בשלב 5.4. במידת הצורך, להסיר 1 x 106 תאים עבור cy, להזרים את הביטוי הגנטי ואת הפנוטיפים. ראה שלב 9.5.1 ושולחן החומרים לנוגדנים מומלצים ולגיבוש אסטרטגיה. צנטריפוגה את התאים ב 600 x g עבור 10 דקות ב 25 ° c. מזף את המדיה ומשהה מחדש את התאים במדיית הרחבה לריכוז של 1 x 106 תאים/mL. זרעי כל גז חדיר היטב של צלחת 6-היטב עם 5 מ ל של תאים. שכבת בזהירות 25 מ ל נוספים של מדיה הרחבה לכל היותר.הערה: אנו מוסיפים את התאים באמצעי אחסון קטן ולאחר מכן שכבות את המדיה הנותרת כך שהתאים יישארו בתחתית הבאר. מודטה את התאים הפרעה ב 37 ° צ’ ב 5% שכונתיות2 חממה עבור 4 ימים. 9. אוסף של תאים מורחבים והערכת הפנוטיפ של אוכלוסיית התאים התהתמרה לאסוף תאים מבארות חדירות גז על ידי הסרת והשמטת 20 mL מדיה. יש לנקוט זהירות כדי למנוע הפרעה לתאים.הערה: אנו מרחיבים את התאים רק 4 ימים ואוספים את התאים בשלב זה. עם זאת, אם מדובר בימים נוספים של תרבות, הסר 20 מ ל של מדיה מבלי להפריע לתאים ולהחליף אותו עם 20 מ ל של מדיית הרחבה טרייה. ללטף את שאר המדיה למעלה ולמטה כדי להוציא את התאים. התקשורת צריכה להיות מאוד מעונן אם התאים גדלו היטב. באמצעות pipet העברה סטרילית, לשטוף כל היטב עם מדיה 3 mL לאסוף כל התאים שיורית. ספור את התאים עם המונה האוטומטי או הומוציטומטר כדי לבדוק את הכדאיות ואת מספר התאים. לבצע זרימה cy, לנסות לקבוע התמרה גנטית ביטוי תא פניטיפים. בדוגמה זו, לקבוע רזוס מקוק PBMC פניטיפ באמצעות נוגדנים מופנה נגד CD4 (M-T477), שיבוט כי הוא תגובתי עם rhCD4 אנדוגני ומכונית rhCD4-MBL; נגד CD3 (SP34-2) ו CD8 (RPA-T8) אשר הכתם תאים T הכולל ותאים CD8 T בהתאמה; נגד קולטן המוות CD95 (DX2) ואת המולקולה שיתוף מגירוי CD28 (CD 28.2) אשר משמשים כדי לקבוע את הזיכרון הפנוטיפ של התאים; ונגד CXCR5 (MU5UBEE) ו MBL (3E7) כדי לזהות את CXCR5 ו CD4-MBL מכונית על התאים התמרה. יכולת ההערכת הכדאיות הוערך. בצבע של יכולת לתקן הכינו תאים לצורך זרימה של cy,. לפצות הורים נוגדן תערובת עבור המספר הכולל של צינורות. העלה את הנפח הכולל באמצעות PBS. הוסיפו את התאים להזרמת צינורות. מקום 0.5 – 1 x 106 תאים לכל צינור. כלול פקדים שליליים כגון תאים לא מוכתמים, כמו גם תאי התמרה מוכתמים. הוסף 2 mL של PBS לתאים, צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ו decant. הוסף 100 μL של שילוב נוגדן לצינורות ו-דגירה עבור 30 דקות at RT. הוסף 2 mL של PBS, צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב RT ו decant. הוסף 300 μL של 1% פאראמפורמלדהיד ו דגירה עבור 15 דקות. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב RT ו decant. הוסף 300 μL של PBS ו לערבב. על הזרם cytometer לרכוש 150,000 אירועים עבור כל מדגם. נתח את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח זרימה.הערה: אסטרטגיית הה, שפורסמה בעבר20. לזיהוי תאים התמרה, תאי שער על לימפוציטים, סינגטים, לחיות, CD3 +, ו MBL + CXCR5 +. לזיהוי אוכלוסיית הזיכרון המרכזית, תאי שער על לימפוציטים, סינגטים, לחיות CD3 +, CD8 +, CD28 + CD95 +. השתמש בתאים לפי הצורך. ניתן להשתמש בתאים למטרות מחוץ לתחומי הפעילות, כגון שיטת הגירה באמצעות העברה של העברת מראה של9 או בתאי מבחנה הריגה5,9. ניתן להשתמש בתאים לעירוי לבעלי חיים. לחלופין, להקפיא את כל התאים הנותרים ב 90% FBS עם 10% diמתיל סולפוקסיד (DMSO) לשימוש מאוחר יותר או ניתוחהערה: בעוד מינון היעד עבור אינפוזיה של תאים הועברו באופן מאומצים לתוך מקוק רזוס אינו מבוסס עדיין, פורסם מחקרים העברה המאמצת בפרימטים שאינם אנושיים השתמשו 0.6 כדי 1.2 x 107 תאים/ק”ג21, 1 כדי 5 x 108 תאים/ק”ג22 ו 1.4 כדי 8 x 108 תאים/ק”ג10. עם טווח זה כמנחה, ניתן להפיק מספיק תאים לעירוי באמצעות פרוטוקול זה של 9 ימים.