Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analyse de la dimérisation Endogenous IRF5

Le facteur de régulation de l’interféron 5 (IRF5) est un important régulateur de transcription qui joue un rôle de premier plan dans la régulation de la réponse immunitaire, en particulier dans la libération de cytokines pro-inflammatoires et d’interférons de type I (IFN)^{1,2 ,3}. La mauvaise régulation de l’IRF5 est un facteur contribuant à de nombreuses maladies auto-immunes, comme en témoignent les divers polymorphismes dans le locus IRF5 qui sont associés au lupus érythémateux systémique, à la sclérose en plaques, à la polyarthrite rhumatoïde, etc.^{4, 5,6,7,8,9,10}. Par conséquent, un essai de détection robuste pour l’état d’activation endogène iRF5 est crucial pour comprendre les voies réglementaires et les effets en aval de l’IRF5 dans un contexte cellulaire physiologiquement pertinent.

IRF5 est constitutivement exprimé dans les monocytes, les cellules dendritiques (DC), les cellules B, et les macrophages^1,11. Comme avec d’autres facteurs de transcription de famille d’IRF, IRF5 réside dans le cytoplasme dans son état latent. Lors de l’activation, IRF5 est phosphorylé et forme des homodimères, qui se translocalisent ensuite dans le noyau et se lient à des éléments réglementaires spécifiques des gènes codant les IFN de type I et les cytokines pro-inflammatoires, induisant éventuellement l’expression de ces gènes^{1 ,2,11,12,13}. IRF5 régule les réponses immunitaires innées en aval de divers récepteurs de type Toll (TLR), tels que TLR7, TLR 8, et TLR 9, qui sont localisés en endosomes et utilisent MyD88 pour signaler^1,11,14. Ces TLR reconnaissent principalement les espèces étrangères d’acide nucléique telles que l’ARN à brin unique (arDR) et l’ADN CPG non méthylé qui sont symptomatiques d’une infection^15,16,17,18. IRF5 a été montré pour réguler les réponses immunitaires contre les infections bactériennes, virales et fongiques^19,20,21. Compte tenu du rôle influent et diversifié de l’IRF5 dans le système immunitaire, l’amélioration ou l’amortissement de l’activité IRF5 pourrait servir de nouvelle voie pour le développement d’agents thérapeutiques²². Par conséquent, il est essentiel de développer un protocole pour surveiller l’état d’activation de l’IRF5 endogène pour permettre une étude approfondie des voies et des mécanismes régulant l’activité IRF5 dans différents types de cellules.

Au meilleur de notre connaissance, aucun analyse biochimique ou électrophoretic de gel pour l’activation endogène d’IRF5 n’a été édité avant le développement de ce protocole. La phosphorylation s’est avérée être une première étape importante de l’activation de l’IRF5, et un anticorps IRF5 phosphospecific a été développé qui a mené à la découverte et à la confirmation d’un résidu de sérine important pour l’activité^{IRF5 13}. Cependant, alors que l’anticorps détecte clairement iRF5 phosphorylé lorsqu’il est immunoprécipité ou surexprimé²³, il ne détecte pas la phosphorylation IRF5 dans une cellule entière lysate dans nos mains (données non montrées). La dimérisation est la prochaine étape de l’activation de l’IRF5, et de nombreuses études importantes à ce jour sur lesquelles on s’est appuyée sur la surexpression de l’IRF5 étiqueté eilluant épitope, souvent dans des types de cellules non pertinentes qui n’expriment normalement pas IRF5^{11,12 ,24,25}. Des études antérieures ont montré que l’IRF5 dimérisé ne peut pas toujours se translocaliser dans le noyau et n’est donc pas nécessairement pleinement activé^25,26. Un essai pour la localisation nucléaire endogène D’IRF5 a été développé pour évaluer l’activation d’IRF5 par la cytométrie de flux d’imagerie²⁷. Cet essai a été appliqué dans des études qui ont été cruciales pour comprendre l’activité IRF5, en particulier dans les types de cellules primaires ou rares^28,29 et a grandement avancé les connaissances dans le domaine. Cependant, cet exemple repose sur un instrument spécialisé qui n’est pas largement disponible pour les chercheurs. En outre, il est souvent nécessaire d’étudier les premières étapes de l’activation tout en disséquant les voies réglementaires IRF5 et en identifiant les régulateurs en amont et les composantes de la voie. Cette étude fournit un analyse biochimique robuste et fiable pour les événements d’activation précoce de l’IRF5 qui peut être effectuée dans des laboratoires équipés d’outils de biologie moléculaire. Le protocole décrit ici sera très utile dans l’étude des voies et des mécanismes des actions IRF5, en particulier lorsqu’il est combiné avec des essais orthogonaux tels que l’analyse cytométrique flux d’imagerie de la localisation nucléaire IRF5^{23, 27,28,30}.

L’électrophoresis de gel de polyacrylamide indigène (PAGE indigène) est une méthode largement utilisée pour analyser des complexes de protéine^31,32. Contrairement à l’électrophorèse de gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE), PAGE indigène sépare les protéines en fonction de leur forme, de leur taille et de leur charge. Il conserve également la structure indigène de protéine sans dénaturation^31,33,34,35. Le protocole présenté tire parti de ces caractéristiques de page native et détecte les formes monomériques et dimériques de l’IRF5. Cette méthode est particulièrement importante pour détecter les événements d’activation précoce parce qu’il n’existe aucun anticorps disponible dans le commerce qui puisse détecter l’IRF5 phosphorylé endogène. Auparavant, plusieurs études publiées utilisaient page native pour évaluer la dimerisation IRF5. Cependant, la majorité de ces études dépendaient de la surexpression de l’IRF5 exogène étiqueté eépitore pour analyser le statut d’activation^{2,13,24,36,37} . Ce travail présente un protocole étape par étape pour l’analyse de la dimérisation iRF5 endogène via une technique PAGE indigène modifiée dans une lignée de cellules dendritiques plasmacytoïdes humaines (pDC), où l’activité IRF5 s’est avérée cruciale pour sa fonction^{1, 38,39,40}. Cette même technique a été appliquée à d’autres lignées^{cellulaires 23}.