Native Polyacrylamidde Gel Electrophesis Análisis de la dimerización endógena IRF5

El factor regulador del interferón 5 (IRF5) es un importante regulador de la transcripción que desempeña un papel destacado en la regulación de la respuesta inmunitaria, particularmente en la liberación de citoquinas proinflamatorias e interferones de tipo I (IFN)^{1,2 ,3}. La desregulación de IRF5 es un factor que contribuye a numerosas enfermedades autoinmunes, como lo demuestran varios polimorfismos en el locus IRF5 que están asociados con lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, artritis reumatoide,^{etc. 4, 5,6,7,8,9,10}. Por lo tanto, un ensayo de detección robusto para el estado de activación endógeno IRF5 es crucial para entender las vías regulatorias y los efectos posteriores de IRF5 en un contexto celular fisiológicamente relevante.

IRF5 se expresa constitutivamente en monocitos, células dendríticas (CC), células B y macrófagos^1,11. Al igual que con otros factores de transcripción de la familia IRF, IRF5 reside en el citoplasma en su estado latente. Tras la activación, IRF5 es fosforilado y forma homodímeros, que luego se trasladan al núcleo y se unen a elementos reguladores específicos de genes que codifican IFN de tipo I y citoquinas proinflamatorias, induciendo finalmente la expresión de estos genes^{1 ,2,11,12,13}. IRF5 regula las respuestas inmunitarias innatas aguas abajo de varios receptores similares a los peajes (TLR), como TLR7, TLR 8 y TLR 9, que se localizan en endosomas y utilizan MyD88 para la señalización^1,11,14. Estos TLR reconocen principalmente especies de ácido nucleico extraños como EL ARN de una sola cadena (ssRNA) y el ADN CpG no metilado que son sintomáticos de una infección^15,16,17,18. IRF5 ha demostrado regular las respuestas inmunitarias contra infecciones bacterianas, virales y fúngicas^19,20,21. Teniendo en cuenta el papel influyente y diverso de IRF5 en el sistema inmunológico, mejorar o amortiguar la actividad del IRF5 podría servir como una vía novedosa para el desarrollo de agentes terapéuticos^22. Por lo tanto, es fundamental desarrollar un protocolo para monitorear el estado de activación del IRF5 endógeno para permitir una investigación exhaustiva de las vías y mecanismos que regulan la actividad de IRF5 en diferentes tipos de células.

Hasta nuestro conocimiento, no se ha publicado ningún ensayo electroforético bioquímico o gel para la activación endógena de IRF5 antes del desarrollo de este protocolo. Se ha demostrado que la fosforilación es un primer paso importante de la activación del IRF5, y se desarrolló un anticuerpo fosfoespecífico IRF5 que condujo al descubrimiento y confirmación de un residuo de serina importante para la actividad¹³de IRF5. Sin embargo, mientras que el anticuerpo detecta claramente iRF5 fosforilado cuando se inmunoprecipita o sobreexpresa²³, no detecta la fosforilación IRF5 en un lisato de células enteras en nuestras manos (datos no mostrados). La dimerización es el siguiente paso de la activación iRF5, y muchos estudios importantes hasta la fecha que investigan este paso se basaron en la sobreexpresión de IRF5 etiquetado con epítopos, a menudo en tipos de celda irrelevantes que normalmente no expresan IRF5^{11,12 ,24,25}. Estudios anteriores han demostrado que el Dimerizado IRF5 no siempre puede translocaren en el núcleo y por lo tanto no está necesariamente completamente activado^25,26. Se desarrolló un ensayo para la localización nuclear endógena IRF5 para evaluar la activación de IRF5 mediante la citometría de flujo de imágenes^27. Este ensayo se ha aplicado en estudios que fueron cruciales para entender la actividad del IRF5, especialmente en los tipos de células primarias o raras^28,29 y avanzaron en gran medida el conocimiento en el campo. Sin embargo, este ensayo se basa en un instrumento especializado que no está ampliamente disponible para los investigadores. Además, a menudo es necesario investigar los pasos iniciales de la activación mientras se disecciónn las vías reguladoras IRF5 y se identifican los reguladores ascendentes y los componentes de la vía. Este estudio proporciona un ensayo bioquímico robusto y fiable para los eventos de activación temprana de IRF5 que se puede realizar en laboratorios equipados con herramientas de biología molecular. El protocolo descrito aquí será muy útil para investigar las vías y mecanismos de las acciones iRF5, especialmente cuando se combina con ensayos ortogonales como el análisis citométrico del flujo de imágenes de la localización nuclear IRF5^{23, 27,28,30}.

La electroforesis nativa de gel de poliacrilamida (PAGE nativa) es un método ampliamente utilizado para analizar complejos proteicos^31,32. A diferencia de la electroforesis de gel de poliacrilamida de dodecilosulfato sódico (SDS-PAGE), PAGE nativa separa las proteínas en función de su forma, tamaño y carga. También conserva la estructura proteica autóctona sin desnaturalización^31,33,34,35. El protocolo presentado aprovecha estas características de PAGE nativo y detecta las formas monoméricas y diminutas de IRF5. Este método es particularmente importante para detectar eventos de activación temprana porque no hay ningún anticuerpo disponible comercialmente adecuado que pueda detectar IRF5 fosforilado endógeno. Anteriormente, varios estudios publicados utilizaban PAGE nativo para evaluar la dimización de IRF5. Sin embargo, la mayoría de estos estudios dependían de la sobreexpresión de IRF5 con etiqueta epitope exógena para analizar el estado de activación^{2,13,24,36,37} . Este trabajo presenta un protocolo paso a paso para analizar la dimización endógena IRF5 a través de una técnica PAGE nativa modificada en una línea de célula dendrítica plasmacitoide humana (pDC), donde se ha demostrado que la actividad IRF5 es crucial para su función^{1, 38,39,40}. Esta misma técnica se ha aplicado a otras líneas celulares²³.