Родной Полякриламимид Гель Электрофорез Иммуноблот Анализ эндогенной димеризации IRF5

Интерферон регулятивного фактора 5 (IRF5) является важным регулятором транскрипции, который играет заметную роль в регулировании иммунного ответа, особенно в выпуске провоспалительных цитокинов и интерферонов типа I (IFNs)^{1,2 ,3}. Неправильное регулирование IRF5 является фактором, способствующим многочисленным аутоиммунным заболеваниям, о чем свидетельствуют различные полиморфизмы в локусе IRF5, связанные с системной эритематозом волчанки, рассеянным склерозом, ревматоидным артритом и т.д.^{4, 5,6,7,8,9,10}. Таким образом, надежный детектор обнаружения эндогенного состояния активации IRF5 имеет решающее значение для понимания регуляторных путей и ниже по течению эффектов IRF5 в физиологически актуальном клеточном контексте.

IRF5 является составным образом выражается в моноцитах, дендритных клетках (ДК), В-клетках и макрофагах^1,11. Как и в других факторах транскрипции семьи IRF, IRF5 находится в цитоплазме в ее скрытом состоянии. После активации IRF5 фосфорилировался и образует гомодимеры, которые затем перемещаются в ядро и связываются с определенными регуляторными элементами генов, кодирующих тип I IFNs и провоспалительных цитокинов, что в конечном итоге приводит к экспрессии этих генов^{1 ,2,11,12,13}. IRF5 регулирует врожденные иммунные реакции вниз по течению различных платных рецепторов (TLRs), таких как TLR7, TLR 8 и TLR 9, которые локализованы в эндосомомых и используют MyD88 для сигнализации^1,11,14. Эти TLRs в первую очередь признают иностранные виды нуклеиновой кислоты, такие как одноцепочечная РНК (ssRNA) и неметилированные CPG ДНК, которые являются симптомами инфекции^15,16,17,18. Было показано, что IRF5 регулирует иммунные реакции против бактериальных, вирусных и грибковых инфекций^19,20,21. Учитывая влиятельную и разнообразную роль IRF5 в иммунной системе, повышение или увлажнение активности IRF5 может послужить новым средством для развития терапевтических агентов²². Поэтому крайне важно разработать протокол для мониторинга состояния активации эндогенного IRF5, с тем чтобы обеспечить тщательное исследование путей и механизмов, регулирующих активность IRF5 в различных типах клеток.

Насколько нам известно, до разработки этого протокола не было опубликовано ни одного биохимического или гелевого электрофоретического анализа для эндогенной активации IRF5. Фосфорилирование было показано, что важный первый шаг активации IRF5, и фосфоспецифические антитела IRF5 был разработан, что привело к открытию и подтверждению остатков serine важно для IRF5 деятельности¹³. Однако, в то время как антитела четко обнаруживает фосфорилированный IRF5, когда иммунопроцирование или overexpressed²³, он не может обнаружить IRF5 фосфорилирования в целом лизат клеток в наших руках (данные не показаны). Димеризация является следующим шагом активации IRF5, и многие важные исследования на сегодняшний день расследование этого шага опирался на переэкспрессию эпитоп-тегами IRF5, часто в нерелевантных типов клеток, которые обычно не выражают IRF5^{11,12 ,24,25}. Предыдущие исследования показали, что димеризированный IRF5 не всегда может трансвесироваться в ядро и, следовательно, не обязательно полностью активирован^25,26. Анализ эндогенной локализации ядерной энергии IRF5 был разработан для оценки активации IRF5 с помощью цитометрии потока изображений²⁷. Этот ассеия была применена в исследованиях, которые имеют решающее значение для понимания активности IRF5, особенно в первичных или редких типах клеток^28,29 и значительно продвинули знания в этой области. Однако этот асси опирается на специализированный инструмент, который не пользуется широкой доступностью для исследователей. Кроме того, часто необходимо исследовать начальные этапы активации при вскрытии регуляторных путей IRF5 и выявлении восходящих регуляторов и компонентов путей. Это исследование обеспечивает надежный и надежный биохимический анализ для ранних событий активации IRF5, которые могут быть выполнены в лабораториях, оснащенных молекулярной биологией инструментов. Описанный здесь протокол будет очень полезен при изучении путей и механизмов действий IRF5, особенно в сочетании с ортогональными ассиями, такими как цитометрический анализ циклометрического анализа ядерных локализации IRF5^{23, 27,28,30}.

Родной полиакриламид гель электрофорез (родной PAGE) является широко используемым методом для анализа белковых комплексов^31,32. В отличие от натрия dodecylsulfate полиакриламид гель электрофоресис (SDS-PAGE), родной PAGE отделяет белки на основе их формы, размера и заряда. Он также сохраняет родную структуру белка без денатурации^31,33,34,35. Представленный протокол использует эти особенности родного PAGE и обнаруживает как мономерные, так и димерические формы IRF5. Этот метод особенно важен для обнаружения ранних событий активации, поскольку нет подходящих коммерчески доступных антител, которые могут обнаружить эндогенные фосфорилированные IRF5. Ранее несколько опубликованных исследований использовали родной PAGE для оценки iRF5 димеризации. Тем не менее, большинство из этих исследований зависело от переэкспрессии экзогенных эпитопных меток IRF5 для анализа состояния активации^{2,13,24,36,37} . Эта работа представляет пошаговый протокол для анализа эндогенных IRF5 димеризации с помощью модифицированной родной техники PAGE в плазмоцитной дендритной клетки человека (pDC) линии, где IRF5 деятельности было показано, что решающее значение для его функции^{1, 38,39,40}. Этот же метод был применен к другим клеточным линиям²³.