Native Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese Immunoblot-Analyse der endogenen IRF5-Dimerisierung

Interferon-Regulierungsfaktor 5 (IRF5) ist ein wichtiger Transkriptionsregulator, der eine herausragende Rolle bei der Regulierung der Immunantwort spielt, insbesondere bei der Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen und Typ-I-Interferonen (IFNs)^{1,2 ,3}. Die Fehlregulation von IRF5 ist ein Faktor bei zahlreichen Autoimmunerkrankungen, wie verschiedene Polymorphismen im IRF5-Lokus zeigen, die mit systemischem Lupus erythematodes, Multipler Sklerose, rheumatoider Arthritis usw. assoziiert sind.^{4, 5,6,7,8,9,10}. Daher ist ein robuster Nachweis-Test für den endogenen IRF5-Aktivierungszustand entscheidend für das Verständnis der regulatorischen Pfade und nachgelagerten Wirkungen von IRF5 in einem physiologisch relevanten zellulären Kontext.

IRF5 wird konstitutiv in Monozyten, dendritischen Zellen (DCs), B-Zellen und Makrophagen^1,11ausgedrückt. Wie bei anderen Transkriptionsfaktoren der IRF-Familie befindet sich IRF5 im Zytoplasma in seinem latenten Zustand. Bei aktivierung wird IRF5 phosphoryliert und bildet Homodimere, die sich dann in den Kern transortieren und an spezifische regulatorische Elemente von Genen binden, die Typ I IFNs und pro-inflammatorische Zytokine kodieren, was schließlich die Expression dieser Gene induzieren^{1 ,2,11,12,13}. IRF5 reguliert die angeborenen Immunantworten stromabwärts von verschiedenen tollähnlichen Rezeptoren (TLRs), wie TLR7, TLR 8 und TLR 9, die in Endosomen lokalisiert sind und MyD88 für die Signalisierung^1,11,14verwenden. Diese TLRs erkennen in erster Linie fremde Nukleinsäurearten wie einsträngige RNA (ssRNA) und unmethylierte CpG-DNA, die symptomatisch für eine Infektion^15,16,17,18sind. IRF5 hat gezeigt, dass Immunreaktionen gegen bakterielle, virale, und Pilzinfektionen regulieren^19,20,21. Angesichts der einflussreichen und vielfältigen Rolle von IRF5 im Immunsystem könnte die Verbesserung oder Dämpfung der IRF5-Aktivität als neuer Weg für die Entwicklung von therapeutischen Wirkstoffen dienen²². Daher ist es wichtig, ein Protokoll zur Überwachung des Aktivierungsstatus des endogenen IRF5 zu entwickeln, um eine gründliche Untersuchung der Wege und Mechanismen zur Regulierung der IRF5-Aktivität in verschiedenen Zelltypen zu ermöglichen.

Nach bestem Wissen und Gewissen wurde vor der Entwicklung dieses Protokolls kein biochemischer oder gelelektrophoretischer Assay zur endogenen IRF5-Aktivierung veröffentlicht. Die Phosphorylierung hat sich als wichtiger erster Schritt der IRF5-Aktivierung erwiesen, und es wurde ein phosphospezifischer IRF5-Antikörper entwickelt, der zur Entdeckung und Bestätigung eines für die IRF5-Aktivität wichtigen Serinrückstands führte¹³. Während der Antikörper jedoch deutlich phosphoryliertes IRF5 erkennt, wenn er immunpräzipiert oder überexprimiert^{23 ist,}kann er die IRF5-Phosphorylierung in einem ganzen Zelllysat in unseren Händen nicht erkennen (Daten werden nicht angezeigt). Dimerisierung ist der nächste Schritt der IRF5-Aktivierung, und viele wichtige Studien, die diesen Schritt bisher untersuchten, stützten sich auf die Überexpression von IRF5 mit Epitop-Tag, oft in irrelevanten Zelltypen, die normalerweise Nicht IRF5^{11,12 ausdrücken. ,24,25}. Frühere Studien haben gezeigt, dass dimerisierte IRF5 kann nicht immer in den Kern translosien und ist daher nicht unbedingt voll aktiviert^25,26. Ein Test für die endogene IRF5-Kernlokalisierung wurde entwickelt, um die IRF5-Aktivierung durch bildgebende Durchflusszytometrie²⁷zu bewerten. Dieser Test wurde in Studien angewendet, die für das Verständnis der IRF5-Aktivität entscheidend waren, insbesondere bei primären oder seltenen Zelltypen^28,29 und das Wissen auf diesem Gebiet stark weiterentwickelt. Dieser Test stützt sich jedoch auf ein spezialisiertes Instrument, das forschern nicht allgemein zugänglich ist. Darüber hinaus ist es häufig notwendig, die ersten Schritte der Aktivierung zu untersuchen, während die IRF5-Regulierungspfade seziert und vorgeschaltete Regulierungs- und Signalwegkomponenten identifiziert werden. Diese Studie bietet einen robusten und zuverlässigen biochemischen Test für die frühen Aktivierungsereignisse von IRF5, der in Laboren durchgeführt werden kann, die mit molekularbiologischen Werkzeugen ausgestattet sind. Das hier beschriebene Protokoll wird sehr nützlich sein, um die Wege und Mechanismen von IRF5-Aktionen zu untersuchen, insbesondere in Kombination mit orthogonalen Assays wie der zytometrischen Analyse des bildgebenden Durchflusses der IRF5-Kernlokalisierung^{23, 27,28,30}.

Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (native PAGE) ist eine weit verbreitete Methode zur Analyse von Proteinkomplexen^31,32. Im Gegensatz zur Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) trennt native PAGE Proteine anhand ihrer Form, Größe und Ladung. Es behält auch native Proteinstruktur ohne Denaturierung^31,33,34,35. Das vorgestellte Protokoll nutzt diese Funktionen der nativen PAGE und erkennt sowohl monomere als auch dimerische Formen von IRF5. Diese Methode ist besonders wichtig für die Erkennung von Frühaktivierungsereignissen, da es keinen geeigneten handelsüblichen Antikörper gibt, der endogene phosphorylierte IRF5 detektieren kann. Zuvor wurden in mehreren veröffentlichten Studien native PAGE verwendet, um die IRF5-Dimerisierung zu bewerten. Die meisten dieser Studien hingen jedoch von der Überexpression von exogenem Epitop mit IRF5-Tags ab, um den Aktivierungsstatus^2,13,^{24,36,37 zu analysieren.} . Diese Arbeit stellt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Analyse der endogenen IRF5-Dimerisierung über eine modifizierte native PAGE-Technik in einer menschlichen Plasmazytoid-Dendritischen Zelle (pDC) dar, bei der sich die IRF5-Aktivität als entscheidend für ihre Funktion erwiesen hat^{1, 38,39,40}. Dieselbe Technik wurde auch auf andere Zelllinien^{angewendet 23}.