الأصلي بولياكرياميد هلام الكهربائي تحليل المناعية لIRF5 الذاتية الثنائية

العامل التنظيمي المضاد للفيروسات 5 (IRF5) هو منظم النسخ الهامه التي تلعب دورا بارزا في تنظيم الاستجابة المناعية ، وخاصه في الإفراج عن السايتوكينات الموالية للالتهابات والتداخل من النوع الأول (ifns)^{1،2 ،3}. سوء تنظيم IRF5 هو عامل المساهمة في العديد من امراض المناعة الذاتية, كما يتضح من مختلف اشكال التعدد في الموضع IRF5 التي ترتبط مع الذئبه الحماميه الجهازية, التصلب المتعدد, التهاب المفاصل الروماتويدي, الخ.^{4, 5،6،7،8،9،10}. ولذلك ، فان فحص الكشف القوي لحاله التنشيط IRF5 الذاتية أمر حاسم لفهم المسارات التنظيمية والآثار النهائية لIRF5 في سياق خلوي ذي صله من الناحية الفسيولوجية.

يتم التعبير عن IRF5 بشكل دستوري في الخلايا الاحاديه ، والكريات الجذعية (DCs) ، والخلايا B ، والضامة^1،11. كما هو الحال مع غيرها من عوامل النسخ الاسره IRF, IRF5 يقيم في سيتوتوبلاسما في حالتها الكامنة. عند التنشيط ، IRF5 هو الفوسفارلاتيد واشكال الhomodimers ، والتي بعد ذلك translocate في النواة وربط لعناصر تنظيميه محدده من نوع ترميز الجينات I IFNs والموالية للالتهابات السايتوكينات ، وحمل في نهاية المطاف التعبير عن هذه الجينات^{1 ،2،11،12،13}. ينظم IRF5 الاستجابات المناعية الفطرية في المصب من مختلف المستقبلات التي تشبه الحصيلة (tlrs) ، مثل TLR7 ، tlrs 8 ، و tlrs 9 ، والتي هي مترجمه في التنظير الباطني واستخدام MyD88 للاشاره^1،11،14. هذه tlrs تعترف في المقام الأول أنواع الأحماض النووية الاجنبيه مثل الجيش النيبالي الوحيد الذي تقطعت به السبل (أسانا) والحمض النووي cpg unmethylated التي هي اعراض للعدوى^15,16,17,18. وقد ثبت IRF5 لتنظيم الاستجابات المناعية ضد العدوى البكتيرية والفيروسية والفطرية^19،20،21. النظر في IRF5’s دور مؤثره ومتنوعة في الجهاز المناعي, تعزيز أو الملطف IRF5 النشاط يمكن ان تكون بمثابه وسيله جديده لتطوير العوامل العلاجية²². ومن ثم ، من الاهميه بمكان وضع بروتوكول لرصد حاله تفعيل الIRF5 الذاتية للسماح باجراء تحقيق شامل في المسارات واليات التي تنظم نشاط IRF5 في مختلف أنواع الخلايا.

إلى أفضل ما لدينا من المعرفة ، وقد نشرت اي البيوكيميائية أو هلام الفحص الكهربي لتنشيط IRF5 الذاتية قبل تطوير هذا البروتوكول. وقد تبين ان الفوسفات خطوه اولي هامه من IRF5 التنشيط ، وتم تطوير الأجسام المضادة IRF5 فوسفوسيبيفيك التي أدت إلى اكتشاف وتاكيد بقايا سيرين المهم لنشاط IRF5¹³. ومع ذلك ، في حين ان الأجسام المضادة بوضوح بالكشف عن IRF5 فوسفولات عندما إيمونوبريسيبيتاتيد أو اوفيريكسبريسيد²³، فانه يفشل في الكشف عن IRF5 فوسفولات في خليه كامله محلله في ايدينا (البيانات لم تظهر). ديميريشن هو الخطوة التالية من تفعيل IRF5 ، والعديد من الدراسات الهامه حتى الآن التحقيق في هذه الخطوة تعتمد علي الإفراط في التعبير عن الIRF5 الموسومة ، في كثير من الأحيان في أنواع الخلايا غير ذات الصلة التي لا تعبر عاده IRF5^{11،12 و24و25}. وقد أظهرت الدراسات السابقة ان IRF5 dimerized قد لا translocate دائما في النواةالتالي ليس بالضرورة تفعيلها^{بالبالكامل 25,26}. تم تطوير فحص لتوطين النووية IRF5 الذاتية لتقييم IRF5 التنشيط عن طريق التصوير الخلوي التدفق²⁷. وقد تم تطبيق هذا الفحص في الدراسات التي كانت حاسمه لفهم النشاط IRF5 ، وخاصه في أنواع الخلايا الاوليه أو النادرة^28،29 ومتقدمة إلى حد كبير المعرفة في الميدان. ومع ذلك ، يعتمد هذا الفحص علي أداه متخصصة ليست متاحه علي نطاق واسع للباحثين. وعلاوة علي ذلك ، غالبا ما يكون من الضروري التحقيق في الخطوات الاوليه للتنشيط اثناء تشريح IRF5 المسارات التنظيمية وتحديد الجهات التنظيمية التمهيدية ومكونات المسار. توفر هذه الدراسة فحصا بيوكيميائيا قويا وموثوقا به لاحداث التنشيط المبكرة لIRF5 التي يمكن أداؤها في المختبرات المجهزة باداات البيولوجيا الجزيئية. البروتوكول الموصوف هنا سيكون مفيدا جدا في التحقيق في مسارات واليات IRF5 الإجراءات ، وخاصه عندما يقترن باختبارات متعامدة مثل تحليل تدفق التصوير الخلوي لIRF5 النووية^{23، 27و28و30}.

الأصلي بولياكرياميد هلام الكهربائي (الصفحة الاصليه) هو أسلوب يستخدم علي نطاق واسع لتحليل مجمعات البروتين^31،32. علي عكس الصوديوم دوديسيلكبريتات بولياكرياميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE) ، الصفحة الاصليه تفصل البروتينات علي أساس شكلها وحجمها ، وتهمه. كما انه يحتفظ بنيه البروتين الأصلي دون التشبع^31,33,34,35. البروتوكول المقدمة يستفيد من هذه الميزات من الصفحة الاصليه ويكتشف كلا من موحودي و ديميريك اشكال IRF5. هذا الأسلوب مهم بشكل خاص للكشف عن احداث التنشيط في وقت مبكر لأنه لا يوجد الأجسام المضادة المتاحة تجاريا المناسبة التي يمكن الكشف عن الذاتية فوسفوريلاتيد IRF5. في السابق ، استخدمت العديد من الدراسات المنشورة الصفحة الاصليه لتقييم IRF5 ديميريشن. ومع ذلك ، فان غالبيه هذه الدراسات تعتمد علي الإفراط في التعبير الخارجي-الموسومة IRF5 لتحليل حاله التنشيط^{2،13،24،36،37} . يقدم هذا العمل بروتوكول خطوه بخطوه لتحليل IRF5 الذاتية عن طريق أسلوب الصفحة الاصليه المعدلة في الخلية البشرية الجذعية (pDC) خط ، حيث تم إظهار نشاط IRF5 ان تكون حاسمه لوظيفتها^{1، 38،39،40}. وقد تم تطبيق هذه التقنية نفسها علي خطوط الخلايا الأخرى²³.