内因性IRF5ダイメネレーションのネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動免疫ブロット解析

インターフェロン調節因子5(IRF5)は、特に炎症性サイトカインおよびI型インターフェロン(IFN)1、2の放出において、免疫応答を調節する上で顕著な役割を果たす重要な転写調節因子である。 ^、3.IRF5の誤認は、全身性エリテマトース、多発性硬化症、関節リウマチなどに関連するIRF5遺伝子座の様々な多型によって明らかなように、多数の自己免疫疾患の一因^{である4、5,6,7,8,9,10}.したがって、内因性IRF5活性化状態に対する堅牢な検出アッセイは、生理学的に関連する細胞コンテキストにおけるIRF5の調節経路および下流効果を理解するために重要である。

IRF5は、単球、樹状細胞(DC)、B細胞、およびマクロファー^ジ1、11で構成的に発現される。他のIRFファミリー転写因子と同様に、IRF5は潜伏状態の細胞質に存在する。活性化すると、IRF5はリン酸化され、ホモダイマーを形成し、その後核に転移し、I型IFNおよび炎症性サイトカインをコードする遺伝子の特定の調節要素に結合し、最終的にこれらの遺伝子1の発現を誘導する。 ^,2,11,12,13.IRF5は、エンドソームに局在するTLR7、TLR8、およびTLR9などの様々なトール様受容体(TLR)の下流の自然免疫応答を調節し、シグナル^{伝達1、11、14}にMyD88を使用する。これらのTTLは、主に感染15、16、17、18の症状である一本鎖RNA(ssRNA)および非メチル化CpG DNAなどの外来核酸種を認識する。IRF5は、細菌、ウイルス、および真菌感染症19、20、21に対する免疫応答を調節することが示されている。免疫系におけるIRF5の影響力と多様な役割を考えると、IRF5活性を増強または減衰させることは、^治療薬22の開発のための新しい道として役立つ可能性がある。したがって、異なる細胞型におけるIRF5活性を調節する経路およびメカニズムを徹底的に調査できるように、内因性IRF5の活性化状態を監視するプロトコルを開発することが重要である。

我々の知る限りでは、このプロトコルの開発前に、内因性IRF5活性化のための生化学的またはゲル電気泳動アッセイは公表されていない。リン酸化は、IRF5活性化の重要な第一歩であることが示されており、IRF5^活性13にとって重要なセリン残基の発見と確認につながったリン特異的IRF5抗体が開発された。しかし、抗体は、免疫沈殿または^過剰発現時にリン酸化IRF5を明確に検出する一方で、我々の手の中の全細胞リサートにおけるIRF5リン酸化を検出することができない(データは示されていない)。二量体化はIRF5活性化の次のステップであり、このステップを調査する多くの重要な研究は、通常IRF5^{11、12を発現しない無関係な細胞型において、エピトープタグ付きIRF5の過剰発現に依存していた。、24、25。}これまでの研究では、二分化されたIRF5が必ずしも核に転移するとは限らないため、必ずしも完全に活性化されるとは限らない^{ことが示されている。}内因性IRF5核局在化のためのアッセイは、イメージングフローサイトメ^トリー27によるIRF5活性化を評価するために開発された。このアッセイは、特に一次細胞^型28、29型においてIRF5活性を理解するために重要な研究に適用^され、分野の知識を大幅に進歩させた。しかし、このアッセイは、研究者が広く利用できない特殊な機器に依存しています。さらに、IRF5規制経路を解剖し、上流のレギュレータおよび経路成分を同定しながら、活性化の初期段階を調査する必要が生じることがよくあります。本研究は、分子生物学ツールを搭載したラボで行うことができるIRF5の初期活性化イベントに対して、堅牢で信頼性の高い生化学的アッセイを提供します。ここで説明するプロトコルは、特にIRF5核局在化23のイメージングフローサイトメトリック解析などの直交アッセイと組み合わせると、IRF5作用の経路とメカニズムを調べるのに非常に役立ちます。^27,28,30.

天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ネイティブPAGE)は、タンパク質^{複合体31、32}を分析するために広く使用されている方法である。ドデシルスルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動ナトリウムとは異なり、ネイティブPAGEは、その形状、サイズ、および電荷に基づいてタンパク質を分離します。また、退^{化31、33、34、35}なしでネイティブタンパク質構造を保持します。提示されたプロトコルは、ネイティブPAGEのこれらの機能を利用し、IRF5のモノマーとダイメリックの両方の形式を検出します。この方法は、内因性リン酸化IRF5を検出できる適切な市販の抗体がないため、早期活性化事象を検出するために特に重要である。以前は、いくつかの公開された研究では、ネイティブ PAGE を使用して IRF5 ダイアライゼーションを評価していました。しかし、これらの研究の大半は、活性化状態2、13、24、36、37を分析するために外因性エピトープタグ付きIRF5の過剰発現に依存していました.本研究は、ヒト血漿細胞細胞系樹状細胞(pDC)ラインにおける改変されたネイティブPAGE技術を介して内因性IRF5ダイアライゼーションを解析するためのステップバイステッププロトコルを提示し、そこでIRF5活性がその^機能1に重要であることが示された。 38、39、40。この同じ技術は、他の細胞^株23に適用されている。