מקורי פוליאקרילאמיד ג'ל לטיפול חיסוני כתמי באנליזה של אנדודוגני IRF5 דימרזציה

אינטרפרון התקינה פקטור 5 (IRF5) הוא מווסת שעתוק חשוב המשחק תפקיד בולט בוויסות התגובה החיסונית, במיוחד לשחרור ציטוקינים פרו דלקתיים וסוג אני הפרעות (ifns)^{1,2 ,3}. Misregulation של IRF5 הוא גורם תורם במחלות אוטואימוניות רבות, כפי שניכר על ידי פולימריות שונות ב IRF5 לוקוס כי הם קשורים עם זאבת מערכתית אריתסוס, טרשת נפוצה, דלקת מפרקים שגרונית, וכו ‘^4, . ^{חמש,שש,שבע,שמונה,9,10} לכן, שיטת גילוי חזקה עבור מצב הפעלה אנדודוגני IRF5 היא חיונית להבנת מסלולים הרגולציה ואת ההשפעה של הזרם של IRF5 בהקשר הסלולר הרלוונטי מבחינה פיזיולוגית.

IRF5 הוא מבוטא באופן קונסטיטולי ב מונוציטים, תאים דנדריטים (DCs), B תאים, ו מקרופאגים^1,11. כמו בשאר משפחת IRF מרכיבי התעתיק, IRF5 שוכנת בציטופלסמה במצבו הנסתר. עם ההפעלה, IRF5 הוא זרחנות וצורות הומודימרס, אשר לאחר מכן העברה לתוך הגרעין ולאגד אלמנטים הרגולציה ספציפיים של גנים קידוד סוג I IFNs והפרו-דלקתיות ציטוקינים, בסופו של דבר גרימת הביטוי של גנים אלה^{1 ,2,11,12,13}. IRF5 מווסת את התגובות החיסוניות המורמות במורד של קולטני שונים כמו שיחות (tlrs), כגון TLR7, tlrs 8, ו-tlrs 9, אשר מותאמים לאנזומים ומשתמשים ב-MyD88 עבור איתות^1,11,14. אלה tlrs לזהות בעיקר חומצות גרעין זרות מינים כגון רנ א אחד (ssrna) ו-DNA הסרת מתילated של ה-CpG כי הם סימפטומים של זיהום^15,16,17,18. IRF5 הוכח לווסת את התגובות החיסונית נגד חיידקים, נגיפי, ופטריות זיהומים^19,20,21. בהתחשב IRF5’s תפקיד המשפיע והמגוונים במערכת החיסונית, שיפור או לחות פעילות IRF5 יכול לשמש כשדרה הרומן לפיתוח של סוכנים טיפוליים²². מכאן, זה קריטי לפתח פרוטוקול כדי לפקח על מצב ההפעלה של אנדודוגני IRF5 כדי לאפשר חקירה יסודית של מסלולים ומנגנונים המסדירים פעילות IRF5 סוגי תאים שונים.

למיטב הידע שלנו, לא שיטת ביוכימיה או ג’ל אלקטרופלטית עבור הפעלה אנדודוגני IRF5 פורסמה לפני הפיתוח של פרוטוקול זה. זירחון הוכח להיות צעד ראשון חשוב של הפעלה IRF5, והנוגדן IRF5 מסוים זרחן פותחה כי הוביל גילוי ואישור של סרין שאריות חשוב עבור IRF5 פעילות¹³. עם זאת, בעוד הנוגדן מזהה בבירור IRF5 זרחתי כאשר immunoprecipitated או overexpressed יטא²³, זה לא מצליח לזהות IRF5 זרחון בתאים שלמים בידינו (נתונים לא מוצגים). דימרזציה היא השלב הבא של IRF5 הפעלה, ומחקרים חשובים רבים עד כה בחקירת שלב זה הסתמך על ביטוי יתר של אפירופה-מתויג IRF5, לעתים קרובות בסוגי תאים לא רלוונטיים שאינם מבטאים בדרך כלל IRF5^{11,12 ,24,25}. מחקרים קודמים הראו כי dimerized IRF5 לא תמיד לאתר את הגרעין ולכן הוא לא בהכרח הופעל באופן מלא^25,26. שיטת התאמה לוקליזציה גרעינית IRF5 פותחה כדי להעריך את IRF5 ההפעלה על ידי זרימת הדמיה cy try²⁷. השיקול הזה הוחל במחקרים שהיו חיוניים להבנת פעילות IRF5, במיוחד בסוגי תאים ראשוניים או נדירים^28,29 , ומתקדם מאוד את הידע בתחום. עם זאת, שיטת הפעולה נשענת על כלי מיוחד שאינו זמין באופן נרחב לחוקרים. יתר על כן, לעתים קרובות יש צורך לחקור את הצעדים הראשוניים של ההפעלה תוך מנתח מסלולים IRF5 רגולציה וזיהוי הרגולטורים במעלה ורכיבי מסלול. מחקר זה מספק שיטת ביוכימית איתנה ואמינה לאירועי ההפעלה המוקדמים של IRF5 שניתן לבצע במעבדות המצוידות בכלים ביולוגיים מולקולריים. הפרוטוקול המתואר כאן יהיה שימושי מאוד בחקירת מסלולים ומנגנונים של פעולות IRF5, במיוחד כאשר בשילוב עם אורתוגונאליות מספר כגון הדמיה של זרימת ההדמיה ניתוח ציטוטומטשל IRF5 לוקליזציה גרעינית^{23, 27,28,30}.

פוליאקרילמיד ג’ל אלקטרופורזה (עמוד מקורי) היא שיטה נפוצה לניתוח מתחמי חלבונים^31,32. בניגוד נתרן dodecylsulfate אלקטרופורזה ג’ל אלקטרופורזה (sds-page), דף יליד מפריד חלבונים על בסיס צורתם, גודל, וטעינה. זה גם שומר^{מבנה החלבון המקורי}ללא הדציה^31,33,^34,35. הפרוטוקול המוצג מנצל תכונות אלה של דף מקורי ומזהה הן monomeric ו dimeric צורות של IRF5. שיטה זו חשובה במיוחד לגילוי אירועים הפעלה מוקדמת, כי אין נוגדן המתאים מסחרית זמין שיכול לזהות זרחני IRF5. בעבר, מספר מחקרים שפורסמו השתמשו בעמוד יליד כדי להעריך IRF5 dimerization. עם זאת, רוב המחקרים תלויים בביטוי יתר של אפידוגני-מתויג IRF5 לנתח מצב הפעלה^{2,13,24,36,37} . עבודה זו מציגה פרוטוקול צעד אחר צעד לניתוח אנדוגניים IRF5 dimerization באמצעות שינוי בטכניקה מקורית של דף מקורי (pDC) האדם תא דנדריטי, שם הפעילות IRF5 הוכח קריטי עבור תפקידה^{1, 38,39,40}. אותה טכניקה הוחלה על קווי תאים אחרים²³.