Inheemse polyacrylamidegel elektroforese immunoblot analyse van endogene IRF5 Dimerization

Interferon Regulatory factor 5 (IRF5) is een belangrijke transcriptie regulator die een prominente rol speelt bij het reguleren van de immuunrespons, met name bij de afgifte van pro-inflammatoire cytokinen en type I-interferonen (IFNs)^{1,2 ,3}. Misregulatie van IRF5 is een bijdragende factor in talrijke auto-immuunziekten, zoals blijkt uit verschillende polymorfismen in de IRF5 Locus die geassocieerd zijn met systemische lupus erythematosus, multiple sclerose, reumatoïde artritis, etc.^{4, 5,6,7,8,9,10}. Daarom is een robuuste detectie test voor endogene IRF5 activeringsstatus cruciaal voor het begrijpen van de regelgevings trajecten en downstream-effecten van IRF5 in een fysiologisch relevante cellulaire context.

IRF5 wordt constitutief uitgedrukt in monocyten, dendritische cellen (Dc’s), B-cellen en macrofagen^1,11. Net als bij andere IRF familie transcriptiefactoren, IRF5 verblijft in het cytoplasma in zijn latente toestand. Na activering, IRF5 is fosforyleerd en vormt homodimers, die vervolgens translocate in de Nucleus en binden aan specifieke regelgevende elementen van genen coderen type I IFNs en pro-inflammatoire cytokines, uiteindelijk induceren van de uitdrukking van deze genen^{1 ,2,11,12,13}. IRF5 regelt de aangeboren immuunresponsen stroomafwaarts van verschillende tolachtige receptoren (tlrs), zoals TLR7, TLR 8, en TLR 9, die zijn gelokaliseerd in endosomes en gebruik MyD88 voor signalering^1,11,14. Deze tlr’s herkennen voornamelijk vreemde nucleïnezuur soorten zoals enkelvoudig-streng RNA (ssrna) en niet-gemethyleerd CPG-DNA dat symptomatisch is voor een infectie^15,16,17,18. IRF5 is aangetoond dat het reguleren van immuunresponsen tegen bacteriële, virale, en schimmelinfecties^19,20,21. Gezien IRF5’s invloedrijke en diverse rol in het immuunsysteem, verbetering of demping IRF5 activiteit kan dienen als een roman Avenue voor de ontwikkeling van therapeutische agenten²². Daarom is het van cruciaal belang om een protocol te ontwikkelen om de activeringsstatus van endogene IRF5 te bewaken, om grondig onderzoek te kunnen doen naar de trajecten en mechanismen die IRF5 activiteit in verschillende celtypen reguleren.

Naar beste weten is er geen biochemische of gel-elektrofortische test voor endogene IRF5-activering gepubliceerd voorafgaand aan de ontwikkeling van dit protocol. Fosforylering is aangetoond als een belangrijke eerste stap van IRF5 activatie, en een fosfospecifieke IRF5 antilichaam werd ontwikkeld dat leidde tot de ontdekking en bevestiging van een serine residu belangrijk voor IRF5 activiteit¹³. Terwijl het antilichaam echter duidelijk fosforyleerd IRF5 detecteert bij immunoprecipitated of overexpressie²³, het niet detecteert IRF5 fosforylering in een hele cel lysaat in onze handen (gegevens niet weergegeven). Dimerization is de volgende stap van IRF5 activatie, en vele belangrijke studies tot nu toe het onderzoeken van deze stap was gebaseerd op overexpressie van epitope-Tagged IRF5, vaak in irrelevante celtypen die normaalgesproken niet uitdrukken IRF5^{11,12 ,24,25}. Eerdere studies hebben aangetoond dat dimerized IRF5 niet altijd kan translokaliseren in de Nucleus en dus niet noodzakelijkerwijs volledig geactiveerd^25,26. Een test voor endogene IRF5 nucleaire lokalisatie werd ontwikkeld om IRF5 activering te beoordelen door Imaging flow flowcytometrieonderzoeken²⁷. Deze test is toegepast in studies die cruciaal waren voor het begrijpen van IRF5 activiteit, vooral in primaire of zeldzame celtypen^28,29 en sterk gevorderd de kennis in het veld. Deze test is echter gebaseerd op een gespecialiseerd instrument dat niet algemeen beschikbaar is voor onderzoekers. Verder is het vaak nodig om de initiële stappen van activering te onderzoeken terwijl het ontleden van IRF5 regelgevings trajecten en het identificeren van upstream regulators en traject componenten. Deze studie biedt een robuuste en betrouwbare biochemische test voor de vroege activeringsgebeurtenissen van IRF5 die kunnen worden uitgevoerd in laboratoria die zijn uitgerust met moleculaire biologie tools. Het hier beschreven protocol zal zeer nuttig zijn bij het onderzoeken van de trajecten en mechanismen van IRF5 acties, vooral in combinatie met orthogonale assays zoals de beeldvormings stroom cytometrische analyse van IRF5 nucleaire lokalisatie^{23, 27,28,30}.

Inheemse polyacrylamidegel elektroforese (native page) is een veelgebruikte methode voor het analyseren van eiwitcomplexen^31,32. In tegenstelling tot natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE) scheidt inheemse pagina eiwitten op basis van hun vorm, grootte en lading. Het behoudt ook inheemse eiwitstructuur zonder denaturatie^31,33,34,35. Het protocol gepresenteerd maakt gebruik van deze functies van de inheemse pagina en detecteert zowel monomere en dimeer vormen van IRF5. Deze methode is vooral belangrijk voor het opsporen van vroege activeringsgebeurtenissen, omdat er geen geschikte commercieel beschikbare antilichamen zijn die endogene fosforyleerd IRF5 kunnen detecteren. Eerder, verschillende gepubliceerde studies gebruikt inheemse pagina om te beoordelen IRF5 dimerization. De meerderheid van deze studies hing echter af van de overexpressie van exogene epitope-Tagged IRF5 om de activeringsstatus te analyseren^{2,13,24,36,37} . Dit werk presenteert een stap-voor-stap protocol voor het analyseren van endogene IRF5 door dimerisatie via een gemodificeerde inheemse pagina techniek in een menselijke plasmacytoïde dendritische cel (pDC) lijn, waar IRF5 activiteit is aangetoond dat cruciaal zijn voor zijn functie^{1, 38,39,40}. Deze zelfde techniek is toegepast op andere cellijnen²³.