Análise imunoblot da electroforese do gel do polyacrylamide nativo da dimerization IRF5 endógena

O fator de regulação do interferão 5 (IRF5) é um importante regulador de transcrição que desempenha um papel proeminente na regulação da resposta imune, particularmente na liberação de citocinas pró-inflamatórias e interferões tipo I (ifns)^{1,2 ,3}. A desregulação do IRF5 é um fator contribuinte em inúmeras doenças auto-imunes, como evidente por vários polimorfismos no locus IRF5 que estão associados com lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla, artrite reumatóide, etc.^{4, 5,6,7,8,9,10}. Portanto, um ensaio de detecção robusto para o estado de ativação IRF5 endógena é crucial para compreender as vias reguladoras e os efeitos a jusante da IRF5 em um contexto celular fisiologicamente relevante.

IRF5 é constitutivamente expresso em monócitos, células dendríticas (DCs), células B e^{macrófagos,11}. Como com outros fatores da transcrição da família de IRF, IRF5 reside no citoplasma em seu estado latente. Após a ativação, o IRF5 é fosforilado e forma homodimers, que então translocam para o núcleo e se ligam a elementos regulatórios específicos de genes codificadores tipo I IFNs e citocinas pró-inflamatórias, eventualmente induzindo a expressão desses genes^{1 ,2,11,12,13}. IRF5 regula as respostas imunes inatas a jusante de vários receptores de pedágio (TLRs), como TLR7, TLR 8 e TLR 9, que estão localizados em endossomos e usam MyD88 para sinalização^1,11,14. Estes TLRs reconhecem primeiramente espécies de ácido nucleico extrangeiro tais como o RNA único-encalhado (ssrna) e o ADN unmethylated do CPG que são sintomáticos de uma infecção^15,16,17,18. IRF5 foi demonstrado para regular as respostas imunes contra infecções bacterianas, virais e fúngicas^19,20,21. Considerando IRF5’s papel influente e diversificado no sistema imunológico, potencializando ou umedecendo a atividade IRF5 poderia servir como uma nova avenida para o desenvolvimento de agentes terapêuticos²². Portanto, é fundamental desenvolver um protocolo para monitorar o status de ativação do IRF5 endógeno para permitir uma investigação minuciosa das vias e mecanismos que regulam a atividade IRF5 em diferentes tipos de células.

Ao melhor de nosso conhecimento, nenhum ensaio electrophoretic bioquímico ou do gel para a ativação IRF5 endógena foi publicado antes do desenvolvimento deste protocolo. O phosphorylation foi mostrado para ser um primeiro passo importante da ativação IRF5, e um anticorpo IRF5 phosphospecific foi desenvolvido que conduziu à descoberta e à confirmação de um resíduo serina importante para a atividade IRF5¹³. Entretanto, quando o anticorpo detectar claramente o IRF5 fosforilada quando Immunoprecipitated ou overexpressado²³, não detecta a fosforilação IRF5 em um lisado inteiro da pilha em nossas mãos (dados não mostrados). A dimerização é a próxima etapa da ativação do IRF5, e muitos estudos importantes até o momento investigando este passo dependiam da superexpressão de IRF5 com a tag epitope, muitas vezes em tipos de células irrelevantes que normalmente não expressam IRF5^{,11,12 ,24,25}. Estudos prévios mostraram que a IRF5 dimerizada nem sempre pode ser translocada para o núcleo e, portanto, não é necessariamente totalmente ativada^25,26. Um ensaio para a localização nuclear IRF5 endógena foi desenvolvido para avaliar a ativação IRF5 pelo fluxo de imagem citometria²⁷. Este ensaio tem sido aplicado em estudos que foram cruciais para a compreensão da atividade IRF5, especialmente nos tipos de células primárias ou raras^28,29 e avançou grandemente o conhecimento no campo. No entanto, este ensaio baseia-se em um instrumento especializado que não está amplamente disponível para os pesquisadores. Além disso, muitas vezes é necessário investigar os passos iniciais de ativação, enquanto dissecando IRF5 vias reguladoras e identificando os reguladores upstream e componentes da via. Este estudo fornece um ensaio bioquímico robusto e confiável para os eventos de ativação precoce de IRF5 que podem ser realizados em laboratórios equipados com ferramentas de biologia molecular. O protocolo aqui descrito será muito útil na investigação das vias e mecanismos das ações IRF5, especialmente quando combinados com ensaios ortogonais como a análise citométrica do fluxo de imagem da localização nuclear de IRF5^{23, 27,28,30}.

A electroforese nativa do gel do poliacrilamida (página nativa) é um método amplamente utilizado para analisar complexos da proteína^31,32. Ao contrário do dodecylsulfate do sódio a electroforese do gel do poliacrilamida (SDS-PAGE), página nativa separa proteínas com base em seus forma, tamanho, e carga. Igualmente retém a estrutura nativa da proteína sem desnaturação^31,33,34,35. O protocolo apresentado aproveita esses recursos da página nativa e detecta formas monoméricas e diméricas de IRF5. Este método é particularmente importante para a detecção de eventos de ativação precoce, pois não há nenhum anticorpo comercialmente disponível adequado que possa detectar a IRF5 fosforilada endógena. Anteriormente, vários estudos publicados utilizavam a página nativa para avaliar a dimerização do IRF5. No entanto, a maioria desses estudos dependeu da superexpressão do epítopo exógeno-Tagged IRF5 para analisar o status de ativação^{2,13,24,36,37} . Este trabalho apresenta um protocolo passo-a-passo para analisar a dimerização endógena de IRF5 por meio de uma técnica de página nativa modificada em uma linha de células dendríticas de plasmacitoides humanas (pDC), onde a atividade de IRF5 demonstrou ser crucial para sua função^{1, 38,39,40}. Esta mesma técnica foi aplicada a outras linhas celulares²³.