Кинетический скрининг nuclease деятельности с использованием нуклеиновой кислоты зондов

Nucleases являются класс ферментов, способных расщепления фосфодиестерных связей, которые образуют основную структуру нуклеиновой кислоты молекул. Огромное разнообразие нуклеаз делает их классификацию довольно трудно. Тем не менее, Есть некоторые общие критерии, используемые для описания нуклеазы, такие как предпочтения субстрата (дезоксибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновой кислоты (РНК)), расщепление сайта (эндонуклезаили или exonucleases), или ионной зависимости металла, среди других¹. Nucleases являются высоко сохранены каталитические ферменты, которые имеют основные роли в обоих, прокариотических и эукариотических организмов и были использованы, и продолжают использоваться, как инструменты редактирования генов². Они также являются основополагающими действующими лицами в поддержании ДНК и репликации, помогая сохранить стабильность генома и участвуя в процессах проверки чтения^3. В бактериях, например, нуклеазы были определены в качестве важных факторов вирулентности, способных способствовать выживаемости бактерий за счет снижения эффективности иммунной системы хозяина^{4,5,6,7 ,8}. У млекопитающих, нуклеазы были предложены быть вовлечены в апоптоз⁹, митохондриальный биогенез и содержание¹⁰ и посредничество антибактериальных и противовирусных врожденных иммунных ответов¹¹. Неудивительно, что изменения активности нуклеаза, будь то повышение или отсутствие, были вовлечены в широкий спектр заболеваний человека. Эти заболевания варьируются от широкого спектра раковых заболеваний^12,13 до сердечной гипертрофии¹⁰ или аутоиммунных заболеваний¹⁴. Таким образом, нуклеазы стали интересными кандидатами в качестве биомаркеров для неоднородной группы человеческих условий. В самом деле, nucleases уже показали свой потенциал в качестве успешных диагностических инструментов для выявления инфекций, вызванных конкретными бактериальными агентами, такими как золотистый стафилококк или Escherichia coli^{15, 16}. Во многих типах рака, выражение стафилококковой нуклеи домен-содержащих белков 1 (SND1) рибонуклеазы свидетельствует о плохой прогноз¹⁷. У больных раком поджелудочной железы, повышенный рибонуклеаI (RNase I) сыворотки были зарегистрированы¹⁸ и предлагается быть связаны с раковыми фенотипами клеток¹⁹. В ишемических условиях сердца, таких как инфаркт миокарда или нестабильный стенокардия pectoris, дезоксирибонуклея I (DNase I) уровни сыворотки были показаны, чтобы быть действительным диагностическим маркером^20,21.

Было высказывано что глобальный план деятельности nuclease может быть по-разному в здоровых и положениях заболевания. В самом деле, последние доклады использовали различия в активности нуклеаза различать здоровые и раковые фенотипы²² или для выявления патогенных бактериальных инфекций в видов-специфических образом^15,23. Эти выводы открыли новый путь для использования нуклеаз в качестве биомаркеров болезни. Поэтому существует необходимость в разработке комплексного метода скрининга, способного систематически выявлять связанные с заболеваниями различия в деятельности нуклеаза, которые могут иметь ключевое значение при разработке новых диагностических средств.

В этом виде мы вводим и описываем новый подход к скринингу in vitro(рисунок 1)для выявления чувствительных и специфических зондов, способных дискриминировать деятельность нуклеазы в здоровой и нездоровой, или деятельность, характерную для типа клеток или бактерий. Воспользовавшись модульностью нуклеиевых кислот, мы разработали начальную библиотеку утоленных флуоресцентных олигонуклеотидных зондов, состоящих из всеобъемлющего набора различных последовательностей и химии, оба являющиеся важными параметрами для оформления библиотеки. Эти олигонуклеотидные зонды окружены флюорофором (флуоресцеин амидитом, FAM) и утоляжем (tide quencher 2, T’2) на 5′ и 3′ заканчивается соответственно (Таблица 1). С помощью этого флуоресцентного резонанса передачи энергии (FRET) на основе флюорометрического исследования для измерения кинетики ферментативной деградации, мы смогли определить кандидат зондов с потенциалом для дискриминации дифференциальных моделей нуклеаза деятельности связанных со здоровыми или болезнями. Мы разработали итеративный процесс, в котором создаются новые библиотеки на основе лучших зондов-кандидатов, что позволяет идентифицировать все более конкретные кандидаты зондов в последующих шагах скрининга. Кроме того, этот подход использует каталитический характер нуклеаз для повышения чувствительности. Это достигается за счет использования активируемого характера репортер зондов и способность nucleases постоянно обрабатывать молекулы субстрата, как представляющие ключевые преимущества по сравнению с альтернативными антителами или малых молекул на основе методов скрининга.

Этот подход предлагает весьма модульный, гибкий и простой в реализации инструмент скрининга для идентификации конкретных зондов нуклеиновой кислоты, способных различать здоровые и болезни, и отличную платформу для разработки новых диагностические инструменты, которые могут быть адаптированы для будущих клинических применений. Таким образом, этот подход был использован для выявления нуклеаза деятельности, полученных от Salmonella Typhimurium (здесь называют salmonella) для конкретной идентификации этой бактерии. В следующем протоколе мы сообщаем о методе проверки на бактериальную активность нуклеаза с помощью кинетической экспертизы.