Dépistage cinétique de l'activité nucléane à l'aide de sondes d'acide nucléique

Les nucléases sont une classe d’enzymes capables de ciquer les liaisons phosphodiester qui forment la structure dorsale des molécules d’acide nucléique. La grande diversité des nucléases rend leur classification assez difficile. Cependant, certains critères communs sont utilisés pour décrire les nucléases, comme la préférence pour le substrat (acide désoxyribonucléique (ADN) ou acide ribonucléique (ARN), le site de clivage (endonucleases ou exonuclées), ou la dépendance aux ions métalliques, entre autres¹. Les nucléases sont des enzymes catalytiques hautement conservées qui ont des rôles fondamentaux dans les organismes procaryotes et eucaryotes et ont été utilisées, et continuent d’être utilisées, comme outils d’édition de gènes². Ils sont également des acteurs fondamentaux dans l’entretien et la réplication de l’ADN, aidant à maintenir la stabilité du génome et participant aux processus de relecture³. Chez les bactéries, par exemple, les nucléases ont été identifiées comme des facteurs de virulence importants, capables de promouvoir la survie bactérienne en réduisant l’efficacité du système immunitaire de l’hôte^4,5,6^{,7 ,8}. Chez les mammifères, on a suggéré que les nucléases soient impliquées dans l’apoptose⁹, la biogenèse et l’entretien mitochondriaux¹⁰ et la médiation des réponses immunitaires innées antibactériennes et antivirales¹¹. Comme on pouvait s’y attendre, des altérations de l’activité nucléane, qu’elles soient améliorées ou en l’absence, ont été impliquées dans un large éventail de maladies humaines. Ces maladies vont d’une grande variété de cancers^12,13 à l’hypertrophie cardiaque¹⁰ ou les maladies auto-immunes¹⁴. Par conséquent, les nucléases sont devenues des candidats intéressants comme biomarqueurs pour un groupe hétérogène de conditions humaines. En fait, les nucléases ont déjà démontré leur potentiel en tant qu’outils de diagnostic efficaces pour la détection des infections causées par des agents bactériens spécifiques, tels que Staphylococcus aureus ou Escherichia coli^{15, 16}. Dans beaucoup de types de cancer, l’expression de la protéine de domaine de nucléase staphylococcique-contenante 1 (SND1) ribonuclease est indicative du pronostic pauvre¹⁷. Dans les patients de cancer pancréatique, les niveaux élevés de sérum de ribonuclease I (RNase I) ont été rapportés¹⁸ et ont proposé d’être associés aux phénotypes cancéreux de cellules^19. Dans les affections cardiaques ischémiques, telles que l’infarctus du myocarde ou l’angine de poitrine instable, les niveaux de sérum de désoxyribonuclease I (DNase I) se sont avérés être un marqueur diagnostique valide^20,21.

On a émis l’hypothèse que le plan global de l’activité nucléase peut être différent dans les états sains et les états de maladie. En fait, des rapports récents ont utilisé des différences dans l’activité nucléase pour distinguer entre les phénotypes sains et cancéreux²² ou pour identifier les infections bactériennes pathogènes d’une manière spécifique à l’espèce^15,23. Ces résultats ont ouvert une nouvelle voie pour l’utilisation des nucléases comme biomarqueurs de la maladie. Par conséquent, il est nécessaire de mettre au point une méthode de dépistage complète capable d’identifier systématiquement les différences associées à la maladie dans l’activité nucléase, qui peuvent être d’une importance capitale dans le développement de nouveaux outils de diagnostic.

Dans ce cas, nous introduisons et décrivons une nouvelle approche de dépistage in vitro (figure 1) pour identifier les sondes sensibles et spécifiques capables de discriminer entre l’activité nucléase en bonne santé et malsaine, ou l’activité spécifique à un type de cellule ou de bactéries. Profitant de la modularité des acides nucléiques, nous avons conçu une première bibliothèque de sondes oligonucléotides fluorescentes étanchées composées d’un ensemble complet de différentes séquences et chimies, les deux étant des paramètres importants pour la conception de la bibliothèque. Ces sondes d’oligonucléotide sont flanquées d’un fluorophore (fluorescein amidite, FAM) et d’un quencher (tide quencher 2, TQ2) aux 5′ et 3′ extrémités respectivement (tableau 1). En utilisant cet air fluorométrique basé sur le transfert d’énergie par résonance fluorescente (FRET) pour mesurer la cinétique de la dégradation enzymatique, nous avons pu identifier les sondes candidates ayant le potentiel de discriminer les modèles différentiels d’activité nucléane associés à des états sains ou malades. Nous avons conçu un processus itératif, dans lequel de nouvelles bibliothèques sont créées sur la base des meilleures sondes candidates, qui permet d’identifier des sondes candidates toujours plus spécifiques dans les étapes de dépistage ultérieures. De plus, cette approche tire parti de la nature catalytique des nucléases pour augmenter la sensibilité. Ceci est réalisé en tirant parti de la nature activatable des sondes de reporter et de la capacité des nucléases à traiter continuellement des molécules de substrat, représentant tous deux des avantages clés par rapport aux anticorps alternatifs ou aux méthodes de criblage à base de petites molécules.

Cette approche offre un outil de dépistage hautement modulaire, flexible et facile à mettre en œuvre pour l’identification de sondes d’acide nucléique spécifiques capables de discriminer entre les états sains et les états pathiques, et une excellente plate-forme pour le développement de nouveaux diagnostics qui peuvent être adaptés pour de futures applications cliniques. En tant que tel, cette approche a été utilisée pour identifier l’activité de nucléane dérivée de Salmonella Typhimurium (ci-dessus appelé Salmonella) pour l’identification spécifique de cette bactérie. Dans le protocole suivant, nous rendons compte d’une méthode pour dépister l’activité bactérienne de nucléase utilisant l’analyse cinétique.