קינטי הקרנה של פעילות Nuclease באמצעות חומצות גרעין רגשים

הנוקלאוסים הם מחלקה של אנזימים המסוגלים לעזוב את איגרות הזרחן היוצרות את המבנה העמוד השדרה של מולקולות חומצות גרעין. הגיוון העצום של הנוקלאוסים הופך את הסיווג שלהם לקשה למדי. עם זאת, ישנם מספר קריטריונים נפוצים המשמשים לתיאור נוקלאוסים, כגון העדפה מצע (חומצה deoxyribonucleic (DNA) או חומצה ריבונוקלאית (RNA)), אתר המחשוף (לאנונוקלאוסים או אקסקליסים), או תלות יון מתכת, בין השאר¹. הנוקלאוסים הם בעלי שימור מאוד אנזימים קטליטי שיש להם תפקידים בסיסיים הן, prokaryotic ואורגניזמים איקריוטית ושימשו, ולהמשיך לשמש, כמו כלים לעריכת גנים². הם גם שחקנים בסיסיים בתחזוקת DNA ושכפול, עוזר לשמור על יציבות הגנום והשתתפות בתהליכי קריאה-הוכחה³. בחיידקים, למשל, הנוקלאוסים זוהו כגורמים חשובים התקפה אלימה, מסוגל לקדם הישרדות חיידקית על ידי הפחתת היעילות של המערכת החיסונית של המחשב המארח^{4,5,6,7 ,8}. ב יונקים, הנוקלאוסים הציעו להיות מעורב ב אפופטוזיס⁹, ביוגנזה מיטוכונדריאלי ותחזוקה¹⁰ וגישור של התגובות החיסונית אנטיבקטריאלי ו אנטי ויראליות מולדים¹¹. לא באופן מפתיע, שינויים בפעילות נוקלאז, אם שיפור או חוסר, היו מעורבים במגוון רחב של מחלות אנושיות. מחלות אלה נעות בין מגוון רחב של סרטן^12,13 כדי היפרפרס לב¹⁰ או מחלות אוטואימוניות¹⁴. לכן, הנוקלאוסים הפכו למועמדים מעניינים כסמנים לקבוצה הטרוגנית של התנאים האנושיים. למעשה, הנוקלאוסים כבר הראו את הפוטנציאל שלהם ככלי אבחון מוצלח לאיתור זיהומים הנגרמים על ידי סוכני בקטריאלי ספציפיים, כגון האורהולוקוקוס או^{es, האנציצ’יה} קולי¹⁵, ¹⁶. בסוגים רבים של סרטן, הביטוי של הדומיין נוקלאז המכילים חלבון 1 (SND1) ריבונוקלאז מעיד על פרוגנוזה גרועה¹⁷. בחולי סרטן הלבלב, ריבונוקלאז מוגבה (rnase i) רמות סרום דווחו¹⁸ הציע להיות משויך עם פנוטיפים תאים סרטניים¹⁹. בתנאי לב האיסכמי, כגון אוטם שריר הלב או בלתי יציבה ומלא יציבות, deoxyribonuclease אני (dnase i) רמות סרום הוכחו להיות סמן אבחון חוקי^20,21.

זה כבר שיערו כי השרטוט הגלובלי של פעילות נוקלאז עשוי להיות שונה במצבי בריא ומחלות. למעשה, דיווחים אחרונים השתמשו הבדלים בפעילות נוקלאז להבדיל בין פנוטיפים בריאים סרטניים²² או לזהות זיהומים חיידקיים פתוגניים באופן ספציפי מינים^15,23. ממצאים אלה נפתחו שדרה חדשה לשימוש נוקלאוסים כמו סמנים של המחלה. לכן, קיים צורך בפיתוח שיטת הקרנה מקיפה מסוגל לזהות בשיטתיות הבדלים הקשורים המחלה בפעילות נוקלאז, אשר עשויה להיות חשיבות מרכזית בפיתוח של כלי אבחון חדשים.

להלן, אנו מציגים ומתארים חדש בגישה לסינון חוץ גופית (איור 1) כדי לזהות בדיקה רגישה וספציפית מסוגל להפלות בין פעילות נוקלאז בריא ולא בריא, או פעילות ספציפית לסוג של תא או חיידקים. ניצול של המודולריות של חומצות גרעין, עיצבנו ספרייה הראשונית של פלורסנט מנוחלת בדיקה המורכב של מערכת מקיפה של רצפים וchemistries שונים, שניהם להיות פרמטרים חשובים עבור עיצוב הספרייה. הבדיקות הללו הינן מקיפים את משני הגלים האלה באמצעות פלואורוופפור (פלואורואסעין אמדיום, משפחתי) ומוצא (הגאות מקומד 2, TQ2) ב -5 ‘ ו -3 ‘ מסתיים בהתאמה (שולחן 1). באמצעות העברת האנרגיה הזאת תהודה פלורסנט (למדוד) המבוססת על בסיס פלואורומטרי כדי לאמוד את הקינטיקה של השפלה אנזימטית, היינו מסוגלים לזהות בדיקה המועמדים עם פוטנציאל להפלות דפוסי הדיפרנציאליות של פעילות נוקלאז קשורה למצבי בריאות או מחלות. עיצבנו תהליך איטראטיבי, שבו הספריות החדשות נוצרות על בסיס הבדיקות הטובות ביותר, המאפשר זיהוי של בדיקת מועמדים ספציפית יותר בשלבי ההקרנה הבאים. יתר על כן, גישה זו מנצלת את האופי הקטליטי של הנוקלאוסים כדי להגביר את הרגישות. הדבר מושג על ידי ניצול האופי הפעילות של בדיקת הכתב ואת היכולת של נוקלאוסים לעבד באופן רציף מולקולות מצע, הן המייצג יתרונות מרכזיים על נוגדנים חלופיים או מולקולה קטנה מבוססת שיטות הקרנה.

גישה זו מציעה מודולרי מאוד, גמיש וקל ליישם כלי הקרנה לזיהוי של חומצות גרעין ספציפיות מסוגל להפלות בין מדינות בריאות ומחלות, פלטפורמה מצוינת לפיתוח של חדש כלי אבחון שניתן להתאים ליישומים קליניים עתידיים. ככזה, גישה זו שימש כדי לזהות את הפעילות נוקלאז נגזר סלמונלה typhimurium (להלן המכונה סלמונלה) עבור זיהוי ספציפי של חיידקים זה. בפרוטוקול הבא, אנו מדווחים על שיטה למסך עבור פעילות נוקלאז חיידקי באמצעות ניתוח קינטי.