核酸プローブを用いたヌクレアーゼ活性の運動スクリーニング
Summary
変化したヌクレアーゼ活性は、バイオマーカーとしての可能性の根底にある異なるヒト条件に関連している。本論文で提示されるモジュラーで実施しやすいスクリーニング方法論により、疾患のバイオマーカーとしてヌクレアーゼ活性を利用するための特異的核酸プローブを選択することができる。
Abstract
ヌクレアーゼは、リボース糖を連結するホスホジエステル結合の加水分解を触媒することによって核酸を分解する酵素のクラスです。ヌクレアーゼは、ゲノム安定性の維持から病原体に対する保護の提供に至るまで、原核生物および真核生物において様々な重要な生理学的役割を果たします。変化したヌクレアーゼ活性は、細菌感染および癌を含むいくつかの病理学的状態に関連している。この結果、ヌクレアーゼ活性は、特定のバイオマーカーとして利用される大きな可能性を示している。しかしながら、この活性に基づく堅牢で再現性の高いスクリーニング方法は依然として極有である。
本明細書では、核酸プローブを基質として用いたヌクレアーゼ活性のスクリーニングを可能にする方法を紹介し、病理学的状態と健全な状態を区別する範囲を有する。この方法は、特異性を高め、反復的な方法で新しいプローブライブラリを設計する可能性を提供します。したがって、化学的に修飾された核酸の入手可能性を利用して、プローブの設計を強化された機能で改良するためには、複数のスクリーニングが必要です。提案された技術のかなりの可能性は、その柔軟性、高い再現性、および疾患状態に関連するヌクレアーゼ活性のスクリーニングのための汎用性にあります。この技術は、クリニックで大きな可能性を秘めた有望な診断ツールの開発を可能にすることが期待されます。
Introduction
ヌクレアーゼは、核酸分子の骨格構造を形成するホスホジエステル結合を切断することができる酵素のクラスです。ヌクレアーゼの膨大な多様性は、その分類をかなり困難にします。しかしながら、基質嗜好(デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA))、切断部位(エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ)、または金属イオン依存性、とりわけ1のようなヌクレアーゼを記述するために使用されるいくつかの一般的な基準がある。ヌクレアーゼは、原核生物と真核生物の両方で基本的な役割を果たす高度に保存された触媒酵素であり、遺伝子編集ツール2として使用され続けている。また、DNAの維持と複製の基本的なアクターであり、ゲノムの安定性を維持し、校正プロセス3に参加するのに役立ちます。細菌において、例えば、ヌクレアーゼは重要な毒性因子として同定されており、宿主の免疫系4、5、6、7の有効性を低下させることにより細菌生存率を促進することができる、8.哺乳動物において、ヌクレアーゼは、アポトーシス9、ミトコンドリア生体形成および維持10および抗菌および抗ウイルス性自然免疫応答11の調停に関与することが示唆されている。当然のことながら、ヌクレアーゼ活性変化は、増強または欠如のいずれであっても、広範囲のヒト疾患に関与している。これらの疾患は、多種多様な癌12、13から心臓肥大10または自己免疫疾患14まで及んでいる。したがって、ヌクレアーゼは、ヒト状態の異種群のバイオマーカーとして興味深い候補となっている。実際、ヌクレアーゼは、黄色ブドウ球菌や大腸菌15などの特定の細菌剤によって引き起こされる感染症の検出に成功した診断ツールとしての可能性を既に示しています。16.多くの癌タイプにおいて、ブドウ球菌ヌクレアーゼドメイン含有タンパク質1(SND1)リボヌクレアーゼの発現は予後不良を示す17.膵臓癌患者において、リボヌクレアーゼI(RNaseI)血清レベルの上昇が報告されており、癌細胞表現型19に関連することが提案されている。心筋梗塞や不安定狭心症などの虚血性心状態において、デオキシリボヌクレアーゼI(DNaseI)血清レベルは、有効な診断マーカー20、21であることが示されている。
ヌクレアーゼ活性の世界的な青写真は、健康と疾患の状態で異なる可能性があると仮定されています。実際、最近の報告では、ヌクレアーゼ活性の違いを用いて、健康な表現型と癌性表現型22を区別したり、種特異的な方法で病原性細菌感染を同定したりしている。これらの知見は、ヌクレアーゼを疾患のバイオマーカーとして使用するための新しい道を開いた。従って、ヌクレアーゼ活性における疾患関連の相違を系統的に同定できる総合的なスクリーニング法の開発には必要性があり、これは新しい診断ツールの開発において重要な役割を有する可能性がある。
本明細書では、健康および不健康、または細胞または細菌の種類に特異的な活性を区別することができる感受性および特異的プローブを同定するための新しいin vitroスクリーニングアプローチ(図1)を導入し、説明する。核酸のモジュール性を利用して、異なる配列と化学の包括的なセットからなるクエンチされた蛍光オリゴヌクレオチドプローブの初期ライブラリを設計し、ライブラリ設計の重要なパラメータとして設計しました。これらのオリゴヌクレオチドプローブは、フルオロフォア(フルオレセインアミド、FAM)とクエンチャー(タイドクエンチャー2、TQ2)によってそれぞれ5’と3’末端に隣接している(表1)。この蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)ベースの蛍光測定アッセイを用いて酵素分解の動態を測定することで、ヌクレアーゼ活性の微分パターンを区別する可能性のある候補プローブを同定することができた。健康または病気の状態に関連付けられています。.最適な候補プローブに基づいて新しいライブラリが作成される反復プロセスを設計し、その後のスクリーニングステップでより具体的な候補プローブを識別できるようにしました。さらに、このアプローチは、感受性を高めるためにヌクレアーゼの触媒性を利用する。これは、レポータープローブの活性化可能な性質と、代替抗体または低分子ベースのスクリーニング方法に対する重要な利点を表す、基質分子を継続的に処理するヌクレアーゼの能力を利用することによって達成される。
このアプローチは、健康と疾患の状態を区別することができる特定の核酸プローブを識別するための非常にモジュール的で柔軟で簡単なスクリーニングツールを提供し、新しい開発のための優れたプラットフォームを提供します将来の臨床適用のために適応することができる診断用具。このように、このアプローチは、この細菌の特異的同定のためにサルモネラ・チピムリウム(本明細書ではサルモネラ菌と呼ばれる)に由来するヌクレアーゼ活性を同定するために用いられた。以下のプロトコルでは、運動分析を用いて細菌ヌクレアーゼ活性をスクリーニングする方法について報告する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヌクレアーゼ活性の変化は、異なるタイプの癌および細菌感染を含む多種多様な疾患表現型に関連している。これらの改変は、条件14の原因物質であることが提案されるが、他の場合には有害な生理学的事象20または病原性薬剤16、26の結果である。当然のことながら、診断バイオマーカーとしてヌクレアーゼおよ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者たちは、原稿の慎重な改訂と貴重なアドバイスについて、ルイザ・I・ヘルナンデス(リンシェーピング大学)を認めたい。この研究は、クヌート・アンド・アリス・ワレンバーグ財団とスウェーデン政府のリンシェーピング大学先端機能材料に関する材料科学戦略研究領域(教員助成金SFO-Mat-LiU No. 2009-00971)によって支援されました。
Materials
| Black bottom, non-treated 96 well plate | Fisher Scientific | 10000631 | |
| Cytation1 | BioTek | CYT1FAV | |
| Eppendorf tubes | Thermofisher | 11926955 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Microbank cryogenic storage vial containing beads | Pro-Lab Diagnostics | 22-286-155 | |
| Nucleic acid probes | Biomers.net | # | |
| Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2 | Gibco™ | 14040117 | |
| Salmonella enterica subs. Enterica | ATCC | 14028 | |
| Tris-EDTA | Fisher Scientific | 10647633 | |
| Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood | Thermo Fisher Scientific | 10362223 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma Aldrich | 22092 |
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