Screening cinetico dell'attività nucleana utilizzando sonde con acido Nucleic

Le nucleasi sono una classe di enzimi in grado di fendere i legami di fosforestro che formano la struttura della spina dorsale delle molecole di acido nucleico. La grande diversità di nucleasi rende la loro classificazione piuttosto difficile. Tuttavia, ci sono alcuni criteri comuni utilizzati per descrivere le nucleasi, come la preferenza del substrato (acido deossiribonucleico (DNA) o acido ribonucleico (RNA), sito di scissione (endonucleases o esonucleasi), o dipendenza da ioni onani metallici, tra gli altri¹. Le nucleasi sono enzimi catalitici altamente conservati che hanno ruoli fondamentali in entrambi gli organismi procariotici ed eucarioti e sono stati utilizzati, e continuano ad essere utilizzati, come strumenti di editing genico². Sono anche attori fondamentali nella manutenzione e replicazione del DNA, contribuendo a mantenere la stabilità del genoma e partecipando ai processi di proof-reading³. Nei batteri, ad esempio, le nucleasi sono state identificate come importanti fattori di virulenza, in grado di promuovere la sopravvivenza batterica riducendo l’efficacia del sistema immunitario dell’ospite^{4,5,6,7 ,8}. Nei mammiferi, le nucleasi sono state suggerite per essere implicate nell’apoptosi⁹, biogenesi mitocondriale e manutenzione¹⁰ e mediazione delle risposte immunitarie innate antibatteriche e antivirali¹¹. Non sorprende che le alterazioni dell’attività di nucleamento, sia in miglioramento che in mancanza, siano state implicate in una vasta gamma di malattie umane. Queste malattie vanno da un’ampia varietà di tumori^12,13 a ipertrofia cardiaca¹⁰ o malattie autoimmuni¹⁴. Pertanto, le nucleasi sono diventate candidati interessanti come biomarcatori per un gruppo eterogeneo di condizioni umane. Infatti, le nucleasi hanno già mostrato il loro potenziale come strumenti diagnostici di successo per il rilevamento di infezioni causate da specifici agenti batterici, come Staphylococcus aureus o Escherichia coli^{15, 16.}In molti tipi di cancro, l’espressione della proteina ribonuclease nuclease nuclease stafilocca del dominio di nuclease 1 (SND1) è indicativa di prognosi infausta¹⁷. Nei pazienti affetti da cancro al pancreas, sono stati riportati¹⁸ livelli elevati di siero ribonuclease I (RNase I) e proposti di essere associati a fenotipi cellulari cancerosi¹⁹. In condizioni cardiache ischemiche, come l’infarto miocardico o l’angina pectoris instabile, deoxyribonuclease I (DNase I) i livelli del siero sono stati indicati come un valido marcatore diagnostico^20,21.

È stato ipotizzato che il progetto globale dell’attività nuclease potrebbe essere diverso negli stati sani e malati. Infatti, recenti rapporti hanno utilizzato differenze nell’attività nuclease per distinguere tra fenotipi sani e cancerosi²² o per identificare le infezioni batteriche patogene in modo specifico per specie^15,23. Questi risultati hanno aperto una nuova strada per l’uso di nucleasi come biomarcatori della malattia. Pertanto, esiste la necessità di sviluppo di un metodo di screening completo in grado di identificare sistematicamente le differenze associate alle malattie nell’attività nucleana, che possono essere di fondamentale importanza nello sviluppo di nuovi strumenti diagnostici.

In questo articolo, introduciamo e descriviamo un nuovo approccio di screening in vitro (Figura 1) per identificare sonde sensibili e specifiche in grado di discriminare l’attività nucleasea in sano e malsano, o un’attività specifica di un tipo di cellula o batteri. Approfittando della modularità degli acidi nucleici, abbiamo progettato una libreria iniziale di sonde oligonucleotidi fluorescenti quesinella costituita da un insieme completo di sequenze e chimiche diverse, entrambe parametri importanti per la progettazione della biblioteca. Queste sonde oligonucleotide sono affiancate da un fluoroforo (fluorescein amidite, FAM) e da un quencher (quencher di marea 2, TQ2) rispettivamente alle estremità 5′ e 3′(tabella 1). Utilizzando questo saggio fluorometrico basato sul trasferimento di energia a risonanza fluorescente (FRET) per misurare la cinetica della degradazione enzima, siamo stati in grado di identificare le sonde candidate con il potenziale di discriminare i modelli differenziali di attività nucleana associati a stati sani o malati. Abbiamo progettato un processo iterativo, in cui vengono create nuove librerie sulla base delle migliori sonde candidate, che consente l’identificazione di sonde candidate sempre più specifiche nelle successive fasi di screening. Inoltre, questo approccio sfrutta la natura catalitica delle nucleasi per aumentare la sensibilità. Ciò si ottiene sfruttando la natura attivabile delle sonde reporter e la capacità delle nuclesie di elaborare continuamente le molecole di substrato, entrambi rappresentando vantaggi chiave rispetto agli anticorpi alternativi o ai metodi di screening a base di piccole molecole.

Questo approccio offre uno strumento di screening altamente modulare, flessibile e facile da implementare per l’identificazione di specifiche sonde di acido nucleico in grado di discriminare gli stati sani e le malattie, e un’eccellente piattaforma per lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici che possono essere adattati per future applicazioni cliniche. Come tale, questo approccio è stato utilizzato per identificare l’attività di nuclease derivata da Salmonella Typhimurium (qui chiamata Salmonella) per l’identificazione specifica di questo batterio. Nel seguente protocollo, riportiamo un metodo per lo screening dell’attività nucleale batterica utilizzando l’analisi cinetica.