الفحص الحركي للنشاط النواسي باستخدام مجسات الحمض النووي
Summary
وقد ارتبط النشاط النيوداز المتغيرة مع الظروف البشرية المختلفة ، الكامنة وراء إمكاناتها باعتبارها البيولوجية. تسمح منهجيه الفحص النموذجية وسهله التنفيذ المعروضة في هذه الورقة باختيار مجسات محدده من الأحماض النووية لتسخير نشاط النيوداز كمؤشر حيوي للمرض.
Abstract
Nucleases هي فئة من الانزيمات التي تكسر الأحماض النووية عن طريق تحفيز التحلل المائي من السندات الفوسفاوديستر التي تربط السكريات الريبوز. عرض nucleases مجموعه متنوعة من الأدوار الفسيولوجية الحيوية في الكائنات البدائية النواة والنواة الحقيقية ، بدءا من الحفاظ علي استقرار الجينوم لتوفير الحماية ضد مسببات الامراض. وقد ارتبط النشاط النيوداز المتغيرة مع العديد من الحالات المرضية بما في ذلك العدوى البكتيرية والسرطان. وتحقيقا لهذه الغاية ، اظهر نشاط النيوداز امكانيه كبيره للاستغلال باعتباره مؤشرا إحيائيا محددا. ومع ذلك ، فان طريقه الفرز القوية والقابلة للتكرار المستندة إلى هذا النشاط لا تزال مستصوبه للغاية.
هنا ، نقدم طريقه تمكن من فحص نشاط النيوداز باستخدام مجسات الحمض النووي كركائز ، مع نطاق التمييز بين الظروف المرضية والصحية. هذا الأسلوب يوفر امكانيه تصميم مكتبات التحقيق الجديدة ، مع زيادة الخصوصية ، بطريقه تكراريه. التالي ، فان جولات متعددة من الفحص ضرورية لصقل تصميم المجسات مع ميزات محسنه ، مع الاستفادة من توافر الأحماض النووية المعدلة كيميائيا. وتكمن الإمكانات الكبيرة للتكنولوجيا المقترحة في مرونتها واستنساخها العالية وبراعتها في فحص نشاط النيوداز المرتبط بظروف المرض. ومن المتوقع ان تسمح هذه التكنولوجيا تطوير أدوات التشخيص واعده مع إمكانات كبيره في العيادة.
Introduction
Nucleases هي فئة من الانزيمات القادرة علي المرابط السندات فوسفوديستر التي تشكل الهيكل الأساسي لجزيئات الحمض النووي. التنوع الشاسع لل نوكليسيس يجعل تصنيفها صعبه نوعا ما. ومع ذلك ، هناك بعض المعايير الشائعة المستخدمة لوصف النوكلينس ، مثل تفضيل الركيزة (حمض ديكسيريبونريك (DNA) أو حمض الريبونسيك (RNA)) ، موقع الانشقاق (الكريات النووية أو التبرئة) ، أو التبعية أيون المعادن ، من بين أمور أخرى1. Nucleases هي الانزيمات الحفازه المحفوظة للغاية التي لها ادوار أساسيه في كل من الكائنات الحية النواة والنواة وقد استخدمت ، والاستمرار في استخدامها ، وأداات تحرير الجينات2. وهي أيضا جات فاعله أساسيه في صيانة الحمض النووي وتكراره ، مما يساعد علي الحفاظ علي استقرار الجينوم والمشاركة في عمليات القراءة المضادة3. في البكتيريا ، علي سبيل المثال ، تم تحديد نوكليسيس كعوامل الضراوة الهامه ، قادره علي تعزيز بقاء البكتيريا عن طريق الحد من فعاليه الجهاز المناعي للمضيف4،5،6،7 ،8. في الثدييات, وقد اقترح نوكليسيس ان تكون متورطة في المبرمج9, التكوين الحيوي الميتوكوندريا والصيانة10 والوساطة من الاستجابات المناعية الفطرية المضادة للبكتيريا والمضادة للفيروسات11. وليس من المستغرب ان تكون التغيرات في نشاط النيواز ، سواء كانت تعزيزا أو نقصا ، متورطة في مجموعه واسعه من الامراض البشرية. وتتراوح هذه الامراض من مجموعه واسعه من السرطانات12,13 إلى تضخم القلب10 أو امراض المناعة الذاتية14. ولذلك ، أصبحت نوكليسيس المرشحين مثيره للاهتمام كما المؤشرات الحيوية لمجموعه غير متجانسة من الظروف البشرية. في الواقع, وقد أظهرت بالفعل نوكليسيس إمكاناتها كاداات تشخيصيه ناجحه للكشف عن الإصابات الناجمة عن عوامل بكتيرية محدده, مثل المكورات العنقودية الذهبية أو القولونية15, 16. في العديد من أنواع السرطان ، والتعبير عن مكورات النيوداز التي تحتوي علي المجال البروتين 1 (SND1) ريبونكليوداز يدل علي سوء التكهن17. في مرضي سرطان البنكرياس ، تم الإبلاغ عن مستويات المصل المرتفعة (RNase I)18 واقترح ان تكون مرتبطة بالأنماط الظاهرية للخلايا السرطانية19. في حالات القلب الدماغية ، مثل احتشاء العضلة القلبية أو الذبحة الصدرية غير المستقرة ، فقد ثبت ان مستويات مصل الدم (dnase i) لتكون علامة تشخيصيه صالحه20،21.
وقد تم الافتراض بان المخطط العالمي للنشاط النواسي قد يكون مختلفا في الدول الصحية والامراض. في الواقع ، استخدمت التقارير الاخيره الاختلافات في نشاط النيوداز للتمييز بين الأنماط الظاهرية الصحية والسرطانية22 أو للتعرف علي العدوى البكتيرية المسببة للامراض بطريقه محدده من النوع15،23. وقد فتحت هذه النتائج وسيله جديده لاستخدام الجزيئات الحيوية للمرض. ولذلك ، توجد ضرورة لوضع طريقه فرز شامله قادره علي التحديد المنهجي للاختلافات المرتبطة بالامراض في نشاط النيوداز ، والتي قد تكون ذات اهميه رئيسيه في تطوير أدوات تشخيصيه جديده.
هنا ، نقدم ونقدم وصفا لنهج الفحص الجديد في المختبر (الشكل 1) لتحديد المجسات الحساسة والمحددة القادرة علي التمييز بين نشاط النيوداز في صحة وغير صحية ، أو النشاط المحدد لنوع من الخلايا أو البكتيريا. الاستفادة من نمطيه الأحماض النووية ، قمنا بتصميم مكتبه أوليه من المجسات الفلورية التي تتكون من مجموعه شامله من المتواليات المختلفة والكيميائية ، وكلاهما معلم مهم لتصميم المكتبة. ويحيط بهذه المسبارات القليلة النواة فلوكوفيري (فلوريسئين اميسيت ، فأم) والمروي (المد والجزر 2 ، TQ2) في 5 ‘ و 3 ‘ ينتهي علي التوالي (الجدول 1). باستخدام هذا الرنين الفلوري نقل الطاقة (الحنق) علي أساس الفحص الفلوري لقياس حركيه التحلل الانزيمي ، تمكنا من تحديد التحقيقات المرشح مع امكانيه التمييز بين الأنماط التفاضلية للنشاط النيوداز المرتبطة بالدول الصحية أو المرض. قمنا بتصميم عمليه تكراريه ، حيث يتم إنشاء المكتبات الجديدة استنادا إلى أفضل التحقيقات المرشحة ، والتي تسمح بتحديد التحقيقات المرشحة الأكثر تحديدا في خطوات الفرز اللاحقة. وعلاوة علي ذلك ، فان هذا النهج يستفيد من الطبيعة الحفازه لل نوكليسيس لزيادة الحساسية. ويتحقق ذلك من خلال الاستفادة من طبيعة activatable من التحقيقات مراسل وقدره نوكليسيس لمعالجه جزيئات الركيزة باستمرار ، وكلاهما يمثل المزايا الرئيسية علي الأجسام المضادة البديلة أو الصغيرة المستندة إلى جزيء طرق الفرز.
ويوفر هذا النهج أداه فحص ذات وحدات عاليه ومرنه وسهله التنفيذ لتحديد المجسات الخاصة بالأحماض النووية القادرة علي التمييز بين الدول الصحية والامراض ، ومنصة ممتازة لتطوير أدوات التشخيص التي يمكن تكييفها للتطبيقات السريرية في المستقبل. وعلي هذا النحو ، استخدم هذا النهج لتحديد النشاط النيوداز المستمدة من السالمونيلا التيفوئيد (المشار اليها هنا باسم السالمونيلا) لتحديد محدد لهذه البكتيريا. في البروتوكول التالي ، نقوم بالإبلاغ عن طريقه لفحص نشاط النيوداز البكتيري باستخدام التحليل الحركي.
Protocol
Representative Results
Discussion
ارتبطت تعديلات نشاط النيواز بمجموعه واسعه من الأنماط الظاهرية للامراض ، بما في ذلك أنواع مختلفه من السرطان والتهابات البكتيرية. ويقترح ان تكون هذه التعديلات العامل المسبب للشرط14، في حين انها في حالات أخرى هي نتيجة لحدث فسيولوجي ضار20 أو العامل المسبب للامراض<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود أصحاب البلاغ الاعتراف بالسيدة لويزا ا. هيرنانديز (جامعه لينكوبينغ) لمراجعتها المتانيه للمخطوطة وإسداء المشورة القيمة لها. وقد حظي هذا العمل بدعم مؤسسه كنوت واليس فالينبرغ ومنطقه البحوث الاستراتيجية التابعة للحكومة السويدية في مجال علوم المواد المتعلقة بالمواد الوظيفية المتقدمة في جامعه لينكوبينغ (الكلية غرانت SFO-مات-ليو رقم 2009-00971).
Materials
| Black bottom, non-treated 96 well plate | Fisher Scientific | 10000631 | |
| Cytation1 | BioTek | CYT1FAV | |
| Eppendorf tubes | Thermofisher | 11926955 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Microbank cryogenic storage vial containing beads | Pro-Lab Diagnostics | 22-286-155 | |
| Nucleic acid probes | Biomers.net | # | |
| Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2 | Gibco™ | 14040117 | |
| Salmonella enterica subs. Enterica | ATCC | 14028 | |
| Tris-EDTA | Fisher Scientific | 10647633 | |
| Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood | Thermo Fisher Scientific | 10362223 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma Aldrich | 22092 |
References
- Yang, W. Nucleases: diversity of structure, function and mechanism. Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).
- Mason, P. A., Cox, L. S. The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing. Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).
- Berends, E. T., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).
- Kiedrowski, M. R., et al. Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease. PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).
- Morita, C., et al. Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity. PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).
- Hasegawa, T., et al. Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes. Microbiology. 156, 184-190 (2010).
- Moon, A. F., et al. Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae. Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).
- Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria. Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).
- McDermott-Roe, C., et al. Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function. Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).
- Wang, Y. T., et al. A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA. Cell Death & Disease. 7 (11), 2458 (2016).
- Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay. RNA. 24 (5), 739-748 (2018).
- Wan, L., et al. MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors. Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).
- Keyel, P. A. Dnases in health and disease. Developmental Biology. 429 (1), 1-11 (2017).
- Hernandez, F. J., et al. Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe. Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).
- Flenker, K. S., et al. Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity. Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).
- Kannan, N., Eaves, C. J. Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis. Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).
- Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease. International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).
- Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines. European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).
- Fujibayashi, K., et al. Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction. Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).
- Kawai, Y., et al. Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction. Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).
- Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer. Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).
- Machado, I., et al. Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes. Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).
- Worthington Biochemical Corporation. . Manual of Clinical Enzyme Measurements. , (1972).
- Burghardt, E. L., et al. Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia. PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).
- Bibette, J. Gaining confidence in high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (3), 649-650 (2012).
- Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. Aptamers overview: selection, features and applications. Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).
- Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. Phage display: concept, innovations, applications and future. Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).
- Skerra, A. Alternative binding proteins: anticalins – harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities. FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).
- Ku, T. H., et al. Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing. Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).
- Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).
- Gray, B. P., Brown, K. C. Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides. Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).
