Kinetisches Screening der Nuklease-Aktivität mit Nukleinsäuresonden

Nukleasen sind eine Klasse von Enzymen, die in der Lage sind, die Phosphodiesterbindungen zu spalten, die die Rückgratstruktur von Nukleinsäuremolekülen bilden. Die große Vielfalt der Nukleasen macht ihre Klassifizierung ziemlich schwierig. Es gibt jedoch einige gängige Kriterien, die zur Beschreibung von Nukleasen verwendet werden, wie substratpräferenzium (Deoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA)), Spaltungsstelle (Endonukleasen oder Exonukleasen) oder Metallionenabhängigkeit, unter anderem¹. Nukleasen sind hochkonservierte katalytische Enzyme, die sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Organismen eine grundlegendeRolle spielen und als Genbearbeitungswerkzeuge verwendet wurden und weiterhin verwendet werden 2 . Sie sind auch grundlegende Akteure in der DNA-Wartung und -Replikation, helfen, die Genomstabilität zu erhalten und nehmen an Korrekturverfahren teil³. Bei Bakterien wurden beispielsweise Nukleasen als wichtige Virulenzfaktoren identifiziert, die das überleben der Bakterien fördern können, indem sie die Wirksamkeit des^Immunsystemsdes Wirts 4^{,5,6,7 ,8}. Bei Säugetieren, Nukleasen wurden vorgeschlagen, in Apoptose⁹verwickelt werden , mitochondriale Biogenese und Wartung¹⁰ und Vermittlung von antibakteriellen und antiviralen angeborenen Immunantworten¹¹. Es überrascht nicht, dass Nuklease-Aktivitätsänderungen, ob Verbesserung oder Fehlen von, in eine Vielzahl von menschlichen Krankheiten verwickelt sind. Diese Krankheiten reichen von einer Vielzahl von Krebsarten^12,13 bis zu Herzhypertrophie¹⁰ oder Autoimmunerkrankungen¹⁴. Daher sind Nukleasen zu interessanten Kandidaten als Biomarker für eine heterogene Gruppe menschlicher Bedingungen geworden. Tatsächlich haben Nukleasen bereits ihr Potenzial als erfolgreiche diagnostische Instrumente zum Nachweis von Infektionen gezeigt, die durch bestimmte bakterielle Wirkstoffe wie Staphylococcus aureus oder Escherichia coli¹⁵ verursacht werden. ¹⁶. Bei vielen Krebsarten ist die Expression von Staphylokokkennuklease-Domänen-haltigem Protein 1 (SND1) Ribonuklease ein Hinweis auf eine schlechte Prognose¹⁷. Bei Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs wurden erhöhte Ribonuklease-I-Serumspiegel¹⁸ berichtet und vorgeschlagen, mit Krebszellphänotypen in Verbindung gebracht zu werden¹⁹. Bei ischämischen Herzerkrankungen, wie Myokardinfarkt oder instabiler Angina pectoris, desoxyribonuklease I (DNase I) Serumspiegel haben sich als ein gültiger diagnostischer Marker^20,21.

Es wurde vermutet, dass die globale Blaupause der Nuklease-Aktivität in gesunden und Krankheitszuständen unterschiedlich sein kann. Tatsächlich haben jüngste Berichte Unterschiede in der Nukleaseaktivität verwendet, um zwischen gesunden und krebsernen Phänotypen²² zu unterscheiden oder pathogene bakterielle Infektionen artspezifisch zu identifizieren^15,23. Diese Erkenntnisse haben einen neuen Weg für den Einsatz von Nukleasen als Biomarker von Krankheiten eröffnet. Daher besteht die Notwendigkeit für die Entwicklung einer umfassenden Screening-Methode, die in der Lage ist, krankheitsassoziierte Unterschiede in der Nukleaseaktivität systematisch zu identifizieren, die bei der Entwicklung neuer diagnostischer Instrumente von entscheidender Bedeutung sein können.

Hierin führen wir einen neuen In-vitro-Screening-Ansatz ein (Abbildung 1), um empfindliche und spezifische Sonden zu identifizieren, die in der Lage sind, zwischen Nukleaseaktivität bei gesunder und ungesundem Oder einer spezifischen Aktivität einer Zell- oder Bakterienart zu unterscheiden. Unter Ausnutzung der Modularität von Nukleinsäuren haben wir eine erste Bibliothek von abgeschreckten fluoreszierenden Oligonukleotid-Sonden entwickelt, die aus einem umfassenden Satz verschiedener Sequenzen und Chemikalien bestehen, die beide wichtige Parameter für die Bibliotheksgestaltung sind. Diese Oligonukleotid-Sonden werden von einem Fluorophor (Fluorescein-Amidit, FAM) und einem Quencher (Tide Quencher 2, TQ2) an den 5′ bzw. 3′ Enden(Tabelle 1) flankiert. Durch die Verwendung dieses fluoreszierenden Resonanzenergietransfers (FRET) basierenden fluormetrischen Assays zur Messung der Kinetik des enzymatischen Abbaus konnten wir Kandidatensonden mit dem Potenzial identifizieren, differentiale Muster der Nukleaseaktivität zu unterscheiden. mit gesunden oder Krankheitszuständen verbunden sind. Wir haben einen iterativen Prozess entwickelt, bei dem neue Bibliotheken auf der Grundlage der besten Kandidatensonden erstellt werden, der es ermöglicht, immer spezifischere Kandidatensonden in nachfolgenden Screening-Schritten zu identifizieren. Darüber hinaus nutzt dieser Ansatz die katalytische Natur von Nukleasen, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Dies wird erreicht, indem die aktivierbare Natur der Reportersonden und die Fähigkeit von Nukleasen genutzt werden, Substratmoleküle kontinuierlich zu verarbeiten, die beide wichtige Vorteile gegenüber alternativen Antikörpern oder kleinen molekülbasierten Screening-Methoden darstellen.

Dieser Ansatz bietet ein hochmodulares, flexibles und einfach zu implementierendes Screening-Tool zur Identifizierung spezifischer Nukleinsäuresonden, die in der Lage sind, gesunde und krankheitsfördernde Erkrankungen zu unterscheiden, und eine hervorragende Plattform für die Entwicklung neuer diagnostische Nagenzwerkzeuge, die für zukünftige klinische Anwendungen angepasst werden können. Als solcher wurde dieser Ansatz verwendet, um die Nuklease-Aktivität von Salmonella Typhimurium (hier als Salmonellabezeichnet ) für die spezifische Identifizierung dieser Bakterien abgeleitet zu identifizieren. Im folgenden Protokoll berichten wir über eine Methode zum Abschirmen auf bakterielle Nukleaseaktivität mittels kinetischer Analyse.