Examen cinético de la actividad de nucleasa utilizando sondas de ácido nucleico

Las nucleasas son una clase de enzimas capaces de cortar los enlaces de fosfodiester que forman la estructura columna vertebral de las moléculas de ácido nucleico. La gran diversidad de nucleasas hace que su clasificación sea bastante difícil. Sin embargo, existen algunos criterios comunes utilizados para describir las nucleasas, como la preferencia de sustrato (ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN)), el sitio de escote (endonucleasas o exonucleasas) o la dependencia de iones metálicos, entre otros¹. Las nucleasas son enzimas catalíticas altamente conservadas que tienen funciones fundamentales en ambos organismos procariotas y eucariotas y se han utilizado, y siguen utilizándose, como herramientas de edición genética^2. También son actores fundamentales en el mantenimiento y replicación del ADN, ayudando a mantener la estabilidad del genoma y participando en procesos de lectura de prueba³. En bacterias, por ejemplo, las nucleasas se han identificado como factores de virulencia importantes, capaces de promover la supervivencia bacteriana reduciendo la eficacia del sistema inmunitario del huésped^{4,5,6,7 ,8}. En los mamíferos, se ha sugerido que las nucleasas están implicadas en la apoptosis^9,la biogénesis mitocondrial y el mantenimiento¹⁰ y la mediación de las respuestas inmunitarias innatas antibacterianas y antivirales¹¹. No es de extrañar que las alteraciones de la actividad de nucleasa, ya sea la mejora o la falta de, se hayan visto implicadas en una amplia gama de enfermedades humanas. Estas enfermedades van desde una amplia variedad de cánceres^12,13 a hipertrofia cardíaca¹⁰ o enfermedades autoinmunes^14. Por lo tanto, las nucleasas se han convertido en candidatos interesantes como biomarcadores para un grupo heterogéneo de condiciones humanas. De hecho, las nucleasas ya han demostrado su potencial como herramientas de diagnóstico exitosas para la detección de infecciones causadas por agentes bacterianos específicos, como Staphylococcus aureus o Escherichia coli^{15, 16}. En muchos tipos de cáncer, la expresión de la proteína de nuleas estafilocócica 1 (SND1) ribonucleasa es indicativa de mal pronóstico¹⁷. En pacientes con cáncer de páncreas, se han notificado niveles séricos elevados de ribonucleasa I (RNase I)¹⁸ y se ha propuesto asociarse con fenotipos de células cancerosas^19. En afecciones cardíacas isquémicas, como el infarto de miocardio o la angina pecírica inestable, los niveles séricos de desoxirrionucleasa I (DNase I) han demostrado ser un marcador diagnóstico válido^20,21.

Se ha planteado la hipótesis de que el plan global de actividad de nucleasa puede ser diferente en estados sanos y de enfermedades. De hecho, informes recientes han utilizado diferencias en la actividad de nucleasa para distinguir entre fenotipos sanos y cancerosos²² o para identificar infecciones bacterianas patógenas de una manera específica de cada especie^15,23. Estos hallazgos han abierto una nueva vía para el uso de nucleasas como biomarcadores de la enfermedad. Por lo tanto, existe la necesidad de que se elase un método de cribado integral que pueda identificar sistemáticamente las diferencias asociadas a la enfermedad en la actividad de nucleasa, que pueden ser de vital importancia en el desarrollo de nuevas herramientas de diagnóstico.

En este documento, presentamos y describimos un nuevo enfoque de cribado in vitro(Figura 1) para identificar sondas sensibles y específicas capaces de discriminar entre la actividad de nucleasa en sano y insalubre, o la actividad específica de un tipo de célula o bacteria. Aprovechando la modularidad de los ácidos nucleicos, diseñamos una biblioteca inicial de sondas de oligonucleótidos fluorescentes apantallados que consiste en un conjunto completo de diferentes secuencias y químicas, siendo ambos parámetros importantes para el diseño de la biblioteca. Estas sondas de oligonucleótidos están flanqueadas por un fluoróforo (fluoresceína amidita, FAM) y un quencher (tide quencher 2, TQ2) en los extremos de 5′ y 3′ respectivamente(Tabla 1). Mediante el uso de este ensayo fluorométrico basado en transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) para medir la cinética de la degradación enzimática, pudimos identificar las sondas candidatas con el potencial de discriminar patrones diferenciales de actividad de nucleasa asociados con estados sanos o de enfermedad. Diseñamos un proceso iterativo, en el que se crean nuevas bibliotecas basadas en las mejores sondas candidatas, que permite la identificación de sondas candidatas cada vez más específicas en pasos de selección posteriores. Además, este enfoque aprovecha la naturaleza catalítica de las nucleasas para aumentar la sensibilidad. Esto se logra aprovechando la naturaleza activadezal de las sondas de reportero y la capacidad de las nucleasas para procesar continuamente moléculas de sustrato, ambas representando ventajas clave sobre anticuerpos alternativos o pequeños métodos de cribado basados en moléculas.

Este enfoque ofrece una herramienta de cribado altamente modular, flexible y fácil de implementar para la identificación de sondas específicas de ácido nucleico capaces de discriminar entre estados sanos y enfermedades, y una excelente plataforma para el desarrollo de nuevas herramientas de diagnóstico que se pueden adaptar para futuras aplicaciones clínicas. Como tal, este enfoque se utilizó para identificar la actividad de nucleasa derivada de Salmonella Typhimurium (en lo sucesivo, Salmonella)para la identificación específica de esta bacteria. En el siguiente protocolo, informamos sobre un método para detectar la actividad de nucleasas bacterianas mediante el análisis cinético.