Triagem cinética da atividade da nuclease usando sondas de ácido nucleico

Nucleases são uma classe de enzimas capazes de clivagem as ligações fosfosfosfosterques que formam a estrutura espinha dorsal de moléculas de ácido nucleico. A vasta diversidade de nucleases torna a sua classificação bastante difícil. No entanto, existem alguns critérios comuns utilizados para descrever nucleases, como preferência por substrato (ácido desoxiribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA)), local de clivagem (endonucleases ou exonucleases), ou dependência de ions metálico, entre outros¹. Nucleases são enzimas catalíticas altamente conservadas que têm papéis fundamentais em ambos, organismos procarióticos e eucarióticos e têm sido usadas, e continuam a ser usadas, como ferramentas de edição de genes². Eles também são atores fundamentais na manutenção e replicação do DNA, ajudando a manter a estabilidade do genoma e participando de processos de leitura de prova³. Em bactérias, por exemplo, nucleases foram identificados como importantes fatores de virulência, capazes de promover a sobrevivência bacteriana, reduzindo a eficácia do sistema imunológico do hospedeiro^{4,5,6,7 8.} Em mamíferos, nucleases têm sido sugeridos para ser implicado em apoptose⁹, biogênese mitocondrial e manutenção¹⁰ e mediação de antibacteriano e antiviral respostas imunes inatas¹¹. Não surpreendentemente, as alterações de atividade nuclease, seja aprimoramento ou falta de, têm sido implicadas em uma ampla gama de doenças humanas. Estas doenças variam de uma grande variedade de cânceres^12,13 a hipertrofia cardíaca¹⁰ ou doenças auto-imunes¹⁴. Portanto, nucleases tornaram-se candidatos interessantes como biomarcadores para um grupo heterogêneo de condições humanas. Na verdade, nucleases já mostraram seu potencial como ferramentas de diagnóstico bem-sucedidas para a detecção de infecções causadas por agentes bacterianos específicos, como Staphylococcus aureus ou Escherichia coli^{15, 16.}Em muitos tipos de câncer, a expressão da proteína 1 (SND1) contendo domínio estaphylocóco sede é indicativa de mau prognóstico^17. Em pacientes com câncer de pâncreas, níveis elevados de ribeirinhoI (RNase I) foram relatados¹⁸ e propostos para serem associados a fenótipos de células cancerosas¹⁹. Em doenças cardíacas isquêmicas, como infarto do miocárdio ou angina pectoris instáveis, os níveis de soro de desoxiribonuclease I (DNase I) mostraram-se um marcador diagnóstico válido^20,21.

Tem sido a hipótese de que o modelo global de atividade nuclease pode ser diferente em estados saudáveis e doenças. Na verdade, relatórios recentes têm usado diferenças na atividade nuclease para distinguir entre fenótipos saudáveis e cancerosos²² ou para identificar infecções bacterianas patogênicas de uma forma específica da espécie^15,23. Esses achados abriram um novo caminho para o uso de nucleases como biomarcadores da doença. Portanto, existe uma necessidade para o desenvolvimento de um método abrangente de rastreamento capaz de identificar sistematicamente as diferenças associadas à doença na atividade nuclease, o que pode ser de importância fundamental no desenvolvimento de novas ferramentas de diagnóstico.

Aqui, introduzimos e descrevemos uma nova abordagem de rastreamento in vitro (Figura 1) para identificar sondas sensíveis e específicas capazes de discriminar entre a atividade nuclease em saudável e insalubre, ou atividade específica para um tipo de célula ou bactéria. Aproveitando a modularidade dos ácidos nucleicos, projetamos uma biblioteca inicial de sondas oligonucleotídeas fluorescentes saciadas que consistem em um conjunto abrangente de diferentes sequências e químicas, ambos sendo parâmetros importantes para o projeto da biblioteca. Estas sondas oligonucleotide são ladeadas por um fluorofóbico (fluorescein amidita, FAM) e um quencher (maré quencher 2, TQ2) nas extremidades 5′ e 3′, respectivamente (Tabela 1). Ao utilizar este ensaio fluorométrico à base de ressonância fluorescente (FRET) para medir a cinética da degradação enzimática, conseguimos identificar sondas candidatas com potencial para discriminar padrões diferenciais de atividade nuclease estados saudáveis ou de doença. Nós projetamos um processo iterativo, no qual novas bibliotecas são criadas com base nas melhores sondas de candidatos, que permite a identificação de sondas candidatas cada vez mais específicas em etapas de triagem subsequentes. Além disso, essa abordagem aproveita a natureza catalítica dos nucleases para aumentar a sensibilidade. Isto é conseguido aproveitando-se da natureza activatable das pontas de prova do repórter e da habilidade dos nucleases de processar continuamente moléculas substratos, representando vantagens chaves sobre o anticorpo alternativo ou métodos de seleção molécula-baseados pequenos.

Esta abordagem oferece uma ferramenta de triagem altamente modular, flexível e fácil de implementar para a identificação de sondas de ácido nucleico específico capazes de discriminar entre estados saudáveis e de doença, e uma excelente plataforma para o desenvolvimento de novos estados de ácido nucleico capazes de discriminar entre estados saudáveis e de doença, e uma excelente plataforma para o desenvolvimento de novos ferramentas de diagnóstico que podem ser adaptadas para futuras aplicações clínicas. Como tal, esta abordagem foi usada para identificar a atividade nuclease derivada de Salmonella Typhimurium (aqui referido como Salmonella)para a identificação específica desta bactéria. No protocolo a seguir, relatamos um método para rastrear a atividade de nuclease bacteriana usando análise cinética.