Kinetische screening van Nuclease activiteit met behulp van nucleïnezuur sondes

Nucleasen zijn een klasse van enzymen die in staat zijn om de fosfodiësterbindingen die de ruggengraat structuur van nucleïnezuur moleculen vormen, te cleaven. De enorme diversiteit van nucleasen maakt hun classificatie nogal moeilijk. Er zijn echter enkele gemeenschappelijke criteria die worden gebruikt om nucleasen te beschrijven, zoals substraat voorkeur (deoxyribonucleïnezuur (DNA) of ribonucleïnezuur (RNA)), decolleté (endonucleases of exonucleases), of metaalionen afhankelijkheid, onder andere¹. Nucleasen zijn sterk geconjugeerde katalytische enzymen die fundamentele rollen hebben in zowel prokaryote als eukaryote organismen en zijn gebruikt, en blijven worden gebruikt, als gen editing tools². Ze zijn ook fundamentele actoren in DNA-onderhoud en-replicatie, helpen om genoom stabiliteit te houden en deel te nemen aan proof-reading processen³. In bacteriën, bijvoorbeeld, nucleasen zijn geïdentificeerd als belangrijke virulentie factoren, in staat om bacteriële overleving te bevorderen door het verminderen van de werkzaamheid van het immuunsysteem van de gastheer^{4,5,6,7 ,8}. Bij zoogdieren zijn nucleasen gesuggereerd om betrokken te zijn bij apoptosis⁹, mitochondriale biogenese en onderhoud¹⁰ en bemiddeling van antibacteriële en antivirale aangeboren immuunresponsen¹¹. Niet verrassend, Nuclease activiteit veranderingen, of verbetering of gebrek aan, zijn betrokken bij een breed scala van menselijke ziekten. Deze ziekten variëren van een breed scala aan kankers^12,13 tot cardiale hypertrofie¹⁰ of auto-immuunziekten¹⁴. Daarom zijn nucleasen interessante kandidaten geworden als biomarkers voor een heterogene groep menselijke aandoeningen. In feite hebben nucleasen al hun potentieel aangetoond als succesvolle diagnostische hulpmiddelen voor het opsporen van infecties veroorzaakt door specifieke bacteriële agentia, zoals Staphylococcus aureus of Escherichia coli^{15, 16}. in veel soorten kanker is expressie van stafylokokken Nuclease Domain-bevattende proteïne 1 (SND1) ribonuclease indicatief voor slechte prognose¹⁷. Bij patiënten met pancreaskanker zijn verhoogde ribonuclease I (RNase I) serumspiegels gemeld¹⁸ en voorgesteld om te worden geassocieerd met kankerachtige cel fenotypes¹⁹. In ischemische hartaandoeningen, zoals myocardinfarct of instabiele angina pectoris, deoxyribonuclease i (DNase i) serumspiegels is aangetoond dat een geldige diagnostische marker^20,21.

Het heeft zijn veronderstelde dat de globale blauwdruk van Nuclease activiteit kan verschillen in gezonde en ziektetoestanden. In feite hebben recente rapporten gebruik gemaakt van verschillen in Nuclease activiteit om onderscheid te maken tussen gezonde en kankerachtige fenotypes²² of om pathogene bacteriële infecties te identificeren op een soortspecifieke manier^15,23. Deze bevindingen hebben een nieuwe laan geopend voor het gebruik van nucleasen als biomarkers van de ziekte. Daarom bestaat er een noodzaak voor de ontwikkeling van een uitgebreide screeningsmethode die in staat is om systematisch met de ziekte samenhangende verschillen in Nuclease activiteit te identificeren, wat van cruciaal belang kan zijn bij de ontwikkeling van nieuwe diagnostische instrumenten.

Hierin introduceren en beschrijven we een nieuwe in-vitro screening aanpak (Figuur 1) om gevoelige en specifieke sondes te identificeren die kunnen discrimineren tussen Nuclease activiteit in gezond en ongezond, of activiteit specifiek voor een type cel of bacteriën. Door gebruik te maken van de modulariteit van nucleïnezuren, ontwierpen we een initiële bibliotheek van gebluste fluorescerende oligonucleotide sondes bestaande uit een uitgebreide set van verschillende sequenties en chemici, beide zijn belangrijke parameters voor het ontwerp van de bibliotheek. Deze oligonucleotide sondes worden geflankeerd door een de (fluorescein amidite, fam) en een dorstlesser (Tide dorstlesser 2, TQ2) aan respectievelijk 5 ‘ en 3 ‘ uiteinden (tabel 1). Door gebruik te maken van deze fluorometrische assay op basis van fluorescerende resonantie energie overdracht (FRET) om de kinetiek van enzymatische afbraak te meten, konden we kandidaatsondes identificeren met het potentieel om differentiaal patronen van Nuclease activiteit te discrimineren geassocieerd met gezonde of ziektetoestanden. We ontwierpen een iteratief proces, waarin nieuwe bibliotheken worden gemaakt op basis van de beste kandidaat-sondes, die het mogelijk maakt om steeds specifiekere kandidaat-sondes te identificeren in volgende screenings stappen. Bovendien maakt deze aanpak gebruik van de katalytische aard van nucleasen om de gevoeligheid te verhogen. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van de activeerbaar aard van de reporter sondes en het vermogen van nucleasen om substraat moleculen voortdurend te verwerken, die beide belangrijke voordelen ten opzichte van alternatieve antilichamen of kleine op moleculen gebaseerde screeningsmethoden vertegenwoordigen.

Deze aanpak biedt een zeer modulair, flexibel en eenvoudig te implementeren screening tool voor de identificatie van specifieke nucleïnezuur voelers die kunnen discrimineren tussen gezonde en ziektetoestanden, en een uitstekend platform voor de ontwikkeling van nieuwe diagnostische hulpmiddelen die kunnen worden aangepast voor toekomstige klinische toepassingen. Als zodanig werd deze benadering gebruikt om de Nuclease activiteit te identificeren die is afgeleid van salmonella typhimurium (hierna salmonellagenoemd) voor de specifieke identificatie van deze bacteriën. In het volgende Protocol rapporteren we over een methode voor het scherm voor bacteriële Nuclease-activiteit met behulp van kinetische analyse.