Развитие ориентации индуцированных местных поражений в геномах (TILLING) Популяции в малых зерновых культур по этил метанолметанофената мутагенеза
Summary
Описано это протокол для разработки ориентации индуцированных местных поражений в геномах (TILLING) населения в мелких зерновых культур с использованием этилового метанасульфоната (EMS) в качестве мутагена. Также предусмотрен протокол для обнаружения мутаций с помощью асссея Cel-1.
Abstract
Ориентация на индуцированные локальные поражения в геномах (TILLING) является мощным инструментом обратной генетики, который включает в себя химический мутагенез и обнаружение вариации последовательности в генах-мишенях. TILLING является очень ценным функциональным инструментом геномики для проверки генов, особенно в небольших зернах, в которых подходы, основанные на трансформации, имеют серьезные ограничения. Разработка надежной мутагенизированной популяции является ключом к определению эффективности исследования генной валидации на основе TILLING. Популяция TILLING с низкой общей частотой мутаций указывает на то, что непрактично большая популяция должна быть проверена, чтобы найти желаемые мутации, в то время как высокая концентрация мутагена приводит к высокой смертности в популяции, что приводит к недостаточной мутагенизированных особей. После того, как эффективная популяция будет разработана, существует несколько способов обнаружения мутаций в интересуемом гене, и выбор платформы зависит от экспериментального масштаба и наличия ресурсов. Cel-1 ассса и агарозный гель-подход для идентификации мутантов является удобным, воспроизводимым и менее ресурсоемким платформой. Это выгодно тем, что оно простое, не требующее вычислительных знаний, и особенно подходит для проверки небольшого количества генов с базовым лабораторным оборудованием. В настоящей статье описаны методы развития хорошей популяции TILLING, включая подготовку кривой дозировки, мутагенеза и поддержание популяции мутантов, а также скрининг популяции мутантов с использованием анализов Cel-1 на основе ПЦР .
Introduction
Точечные мутации в геномах могут служить исследователям многим полезными целями. В зависимости от их характера и местоположения, эти мутации могут быть использованы для присвоения функций генам или даже различным областям белков, представляющих интерес. С другой стороны, в качестве источника новых генетических вариаций, полезные мутации могут быть выбраны для желаемых признаков с помощью фенотипирования экранов и далее используется в улучшении урожая. TILLING является мощным инструментом обратной генетики, который включает в себя химический мутагенез и обнаружение изменения последовательности в гене-мишени. Впервые разработан в Arabidopsis1 и Drosophilia melanogaster2, TILLING популяций были разработаны и использованы во многих небольших зерновых культур, таких как гексаплоидный хлеб пшеницы (Triticum aestivum)3, ячмень (Hordeum vulgare)4, тетраплоидная пшеница дурума (T. dicoccoides durum)5, диплоидная пшеница (T. monococcum)6 и “D” геном прародитель пшеницы Aegilops tauschii7 . Эти ресурсы были использованы для проверки роли генов в регулировании абиотических и биотических стрессоустойчивость8, регулирующие время цветения9, и развивающихся питательно превосходных сортов сельскохозяйственных культур5.
TILLING, наряду с использованием алкилирующих мутагенных агентов, таких как этил метанесульфонат (EMS), азид натрия, N-метил-N-нитросурея (MNU), и метилметанесульфонат (MMS), имеет преимущества по сравнению с другими инструментами обратной генетики по нескольким причинам. Во-первых, мутагенез может проводиться практически на любом виде или сорте растения10 и не зависит от узкого места трансформации, что особенно сложно в случае мелких зерен11. Во-вторых, в дополнение к генерации нокаут мутации, которые могут быть получены с помощью других подходов проверки генов, ряд неправильности и сплайсинга мутации могут быть вызваны, которые могут различить функции отдельных областей белков, представляющих интерес12. Кроме того, TILLING генерирует бессмертную коллекцию мутаций по всему геному; таким образом, одна популяция может быть использована для функциональной проверки нескольких генов. В отличие от этого, другие инструменты обратной генетики генерировать ресурсы, характерные только для гена в исследовании13. Полезные мутации, выявленные с помощью TILLING, могут быть развернуты в целях размножения и не подлежат регулированию, в отличие от редактирования генов, чья нетрансгенная классификация по-прежнему не определена во многих странах. Это становится особенно актуальным для мелких зерен, которые на международном рынке торгуются14.
TILLING является простой и эффективной стратегией проверки генов и требует разработки мутагенизированных популяций для исследования генов, представляющих интерес. Разработка эффективной мутагенизированной популяции является ключом к определению эффективности исследования генной валидации на основе TILLING. Популяция TILLING с низкой общей частотой мутаций указывает на то, что непрактично большая популяция должна быть проверена на желаемые мутации, в то время как высокая концентрация мутагенов приводит к высокой смертности в популяции и недостаточному числу мутагенизированных особей. После того, как хорошая популяция будет разработана, существует несколько способов обнаружения мутаций в интересуемых генах, а выбор платформы зависит от экспериментального масштаба и наличия ресурсов. Полное секвенирование генома и секвенирование экзома было использовано для характеристики всех мутаций в популяциях TILLING в растениях с небольшими геномами15,16. Exome секвенирование двух популяций TILLING было выполнено в хлебе и пшенице durum и доступно для общественности для выявления желательных мутаций и заказа мутантных линий интереса17. Это большой общественный ресурс с точки зрения наличия желательных мутаций; однако, в исследованиях проверки гена, линия дикого типа должна обладать интересующим геном-кандидатом. К сожалению, это все еще непомерно затратный секвенировать экзома всей популяции TILLING для обратной генетики на основе проверки нескольких генов-кандидатов в другом фоне. Ампликон секвенирования и Cel-1 основе анализы были использованы в обнаружении мутаций в целевых популяций в пшенице, и Cel-1 анализы проще, не требуя вычислительных знаний, и особенно подходят для проверки небольшого числа генов с основными лабораторное оборудование6,18.
В настоящей статье описаны методы развития хорошей популяции TILLING, включая подготовку кривой дозировки, мутагенеза и поддержание популяции мутантов, а также скрининг популяции мутантов с использованием анализов Cel-1 на основе ПЦР . Этот протокол уже успешно реализован в разработке и использовании мутагенизированных популяций Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, ячменя, Aegilops tauchii7, и несколько Другие. Включены явные детали этих методов наряду с полезными советами, которые помогут исследователям развивать популяции TILLING, используя EMS в качестве мутагена в любом небольшом зерновом заводе выбора.
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING является весьма ценным инструментом обратной генетики для проверки генов, особенно для мелких зерен, где трансформационные подходы имеют серьезные узкие места11. Развитие мутагенизированной популяции с высокой частотой мутаций является одним из важнейших этапов в пр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Министерством сельского хозяйства США Национальным институтом продовольствия и сельского хозяйства, Проектом Hatch 1016879 и Мэрилендской сельскохозяйственной экспериментальной станцией через MAES Grant No 2956952.
Materials
| 96 well 1.1 ml microtubes in microracks | National Scientific | TN0946-08R | For collecting leaf tissues |
| Agarose I biotechnology grade | VWR | 0710-500G | |
| Biosprint 96 DNA Plant Kit | Qiagen | 941558 | Kit for DNA extraction |
| Cel-1 endonuclease | Extracted as described by Till et al 2006 | Single strand specific endonuclease | |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | ||
| Ethyl methanesulfonate | Sigma Aldrich | M-0880-25G | EMS, Chemical mutagen |
| Freeze Dry/Shell freeze system | Labconco | For lyophilization of leaf tissue | |
| Kingfisher Flex purification system | Thermo fisher scientific | 5400610 | High throughput DNA extraction robot |
| My Taq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | |
| Nuclease free water | Sigma aldrich | W4502-1L | |
| NuGenius gel imaging system | Syngene | ||
| Orbit Environ-shaker | Lab-line | ||
| SPECTROstar Nano | BMG LABTECH | Nano drop for DNA quantification | |
| T100 Thermal cycler | BIO-RAD | 1861096 |
References
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeted screening for induced mutations. Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).
- Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. Targeted Recovery of Mutations in Drosophila. Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).
- Tsai, H., et al. Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing. Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).
- Caldwell, D. G., et al. A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.). The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).
- Hazard, B., et al. Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat. Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).
- Rawat, N., et al. A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics. BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).
- Rawat, N., et al. TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement. Frontiers in Plant Science. 9, (2018).
- Rawat, N., et al. Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight. Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).
- Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes. Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).
- Greene, E. A., et al. Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis. Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).
- Harwood, W. A. Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat. Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).
- Henikoff, S., Comai, L. Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics. Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).
- Uauy, C., et al. A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat. BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).
- Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat. Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).
- Li, G., et al. The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies. The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).
- Jiao, Y., et al. A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses. The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).
- Krasileva, K. V., et al. Uncovering hidden variation in polyploid wheat. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).
- Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. A Modified TILLING Method for Wheat Breeding. The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).
- Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals. Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).
- Wu, J. -. L., et al. Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics. Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).
- Feldman, M., Levy, A. A. Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat. Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).
- Comai, L. The advantages and disadvantages of being polyploid. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).
- Guo, H., et al. Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Rakszegi, M., et al. Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program. Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).
- Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. Tilling by Sequencing. Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).
